響應面法優化辣蓼黃酮的提取工藝

張 文，胡庭俊，于美玲

（ 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005 ）

中草藥辣蓼為蓼科蓼屬植物，廣泛分布于我國南北各省區，資源豐富，開發利用潛力大[1]。辣蓼的主要生物活性成分為黃酮類化合物，如金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素等[2]，具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種功效，且安全性能高[3-5]。

不同植物所含黃酮類化合物的種類及含量差異較大，因此從不同植物中提取黃酮類化合物的研究備受關注。實驗室常用于優化提取工藝的方法很多，包括單因素試驗、正交試驗[6]、Box-Behnken 響應面試驗等[7]。與其他方法相比，響應面法更準確高效，考慮到了試驗的隨機誤差，在尋求最優結果時對各個因素進行連續性分析，因而廣泛應用于中藥成分提取方面[8]?；诖?，本試驗采用單因素法和Box-Behnken 響應面法，優化提取過程中的液料比、乙醇含量、超聲時間，以期為辣蓼黃酮生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥物辣蓼購自廣西壯族自治區玉林市中藥市場。蘆丁標準品（純度≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

SB-5200DTDN 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、UV-1750紫外分光光度計（島津公司）、CDUPT-1純水儀（成都純越科技有限公司）、EL204分析天平（METTLER TOLEDO）、HEI VAP ADVANTAGE 旋轉蒸發儀（海道夫公司）、Himac CF16RN多用途冷凍離心機（日立公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮含量測定

標準曲線建立：稱取蘆丁標準品10.0 mg，用60%乙醇定容至50.0 mL，制成0.2 g/L蘆丁標準溶液。

標準曲線繪制：將0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL蘆丁標準溶液加入10 mL容量瓶中，按照亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉法測定510 nm處的吸光度。以蘆丁作為參照物計算辣蓼的總黃酮含量。

總黃酮含量=(C×V×n)/m×100%（1）

式中：C表示提取液中黃酮含量（g/mL）；V表示提取液體積（mL）；n表示提取液稀釋倍數；m表示辣蓼黃酮提取物的質量（g）。

1.2.2 改良醇提法提取辣蓼總黃酮

準確稱取10.0 g辣蓼粉末，按照一定的料液比、乙醇含量、超聲時間和超聲溫度進行提取。將辣蓼粉末浸泡0.5 h，45 ℃超聲40 min，80 ℃水浴鍋加熱1.5 h，過濾。將濾渣加入乙醇溶液后再次水浴，重復3 次后合并濾液，以20～25 μm 定性濾紙抽濾，旋轉蒸發至50 mL，冷凍干燥48 h后即得辣蓼黃酮提取物。根據《中華人民共和國藥典法》委員會規定的紫外分光光度法，在510 nm波長處測定吸光度。

1.2.2.1 單因素試驗

根據1.2.2 提取方法的參數進行液料比的選擇。固定乙醇濃度60%、超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min，探究不同液料比（5、10、15、20、25 mL/g）對總黃酮含量的影響。

根據1.2.2 提取方法的參數進行乙醇濃度的選擇。固定液料比20 mL/g、超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min，探究不同的乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對總黃酮含量的影響。

根據1.2.2 提取方法的參數進行超聲時間的選擇。固定液料比20 mL/g、乙醇濃度60%、超聲溫度40 ℃，探究不同的超聲時間（30、40、50、60、70 min）對總黃酮含量的影響。

根據1.2.2 提取方法的參數進行超聲溫度的選擇。固定液料比20 mL/g、乙醇濃度60%、超聲時間40 min，探究不同的超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）對總黃酮含量的影響。

1.2.2.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以液料比（A）、乙醇含量（B）、超聲時間（C）為試驗因素，總黃酮含量為指標，進行響應面試驗。試驗設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設計Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線（見圖1）

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1 可知，回歸方程為y=4.057 1x+0.001 6，R2=0.990 2，線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 液料比對總黃酮含量的影響（見圖2）

圖2 液料比對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoid content

由圖2可知，在乙醇含量、超聲時間和超聲溫度一定的條件下，當液料比由5 mL/g 提高至20 mL/g 時，總黃酮含量隨之增加。分析原因是當液料比小于20 mL/g 時，料液比越高，傳質過程越快，越利于黃酮的提?。划斠毫媳却笥?0 mL/g時，總黃酮含量相對穩定，可能是黃酮已被最大限度提取。由此可知，液料比為20 mL/g 時可在獲得較高黃酮含量的同時減少溶劑的消耗。因此，選擇15、20、25 mL/g作為響應面試驗的因素水平。

2.2.2 乙醇含量對總黃酮含量的影響（見圖3）

圖3 乙醇含量對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ethanol content on total flavonoid content

由圖3可知，在其他3個因素一定的條件下，當乙醇含量由10%提高至60%時，總黃酮含量隨之增加；乙醇含量高于60%時，總黃酮含量呈下降趨勢。因此，選擇50%、60%、70%作為響應面試驗的因素水平。

2.2.3 超聲時間對總黃酮含量的影響（見圖4）

圖4 超聲時間對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoid content

由圖4可知，在液料比、乙醇含量和超聲溫度一定的條件下，超聲時間為30～40 min 時，總黃酮含量上升，40 min達到峰值，之后急劇下降，在50～70 min 趨于平緩。因此，選擇30、40和50 min作為響應面試驗的因素水平。

2.2.4 超聲溫度對總黃酮含量的影響（見圖5）

圖5 超聲溫度對總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoid content

由圖5可知，在液料比、乙醇含量和超聲時間一定的條件下，超聲溫度在20～60 ℃時，總黃酮含量趨于平緩，其中超聲溫度在40 ℃時總黃酮含量最高。因此，將超聲溫度設定為40 ℃，考察其他變量。

2.3 響應面優化試驗結果

采用Box-Behnken設計試驗，以液料比（A）、乙醇濃度（B）和超聲時間（C）為自變量，總黃酮含量為因變量，響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Tab.2 Box-Behnken experimental results

2.3.1 多元二次回歸方程

總黃酮含量（Y）與試驗因素的回歸方程：Y=19.03+1.39A+0.758 8B+1.45C-0.407 5AB-1.3AC-0.74BC-2.61A2-1.91B2-1.3C2

該回歸方程模型中，F值=233.33，P＜0.01，表明模型的整個回歸區域擬合很好；P＞0.05，表明相對于純誤差差異無統計學意義，R2=0.996 7，表明試驗相關性較好，能夠使用此模型對總黃酮含量進行分析和預測，結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance for regression mode

由表3 可知，各因素對總黃酮含量大小的影響依次是A＞B＞C，液料比和乙醇含量對總黃酮含量的影響達到極顯著水平，超聲時間不顯著；A2、B2和C2影響極顯著。

2.3.2 各因素交互作用對總黃酮含量的影響（見圖6）

圖6 各因素交互作用對總黃酮含量的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on total flavonoid content

響應面坡度越陡峭，表示相應的響應值對相關條件越為敏感，該因素對總黃酮含量影響越大。

由圖6 可知，A和C之間交互作用對總黃酮含量影響最明顯，與方差分析中回歸模型系數顯著性檢驗結果一致。三者之間的等高線呈橢圓形，表明各因素兩兩之間交互作用顯著。

2.3.3 最佳提取條件及驗證試驗

利用Design-Expert軟件對提取工藝參數進行優化，得到最佳工藝參數為：液料比21.430 mL/g、乙醇含量61.955%、超聲時間38.592 min，預測總黃酮含量為19.292%。為方便試驗操作，將優化后的工藝條件四舍五入為液料比21 mL/g、乙醇含量62%、超聲時間39 min，試驗重復3次，結果見表4。

由表4 可知，在上述條件下得到總黃酮的平均含量為19.108%，與預測值接近，表明優化的工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 討論

辣蓼廣泛分布于我國廣西、湖南、貴州等地區，具有良好的抗氧化效果。辣蓼富含的黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結構的植物次級代謝產物，在植物界中廣泛存在[9]。黃酮類化合物不僅影響植物的生長發育，而且還具有抗病毒和抗氧化等多種活性[10]。

吳永玲等[11]研究表明，響應面法優化提取的蛇床子總黃酮不僅對蘋果黃蚜和朱砂葉螨的48 h 校正死亡率均大于50%，且對蘋果腐爛病菌和油菜菌核病菌也具有較強的抑菌活性。李克香等[12]試驗表明，超聲波酶法輔助提取的紫萁黃酮能夠有效清除自由基，且清除率呈劑量依賴性。蘇慧慧等[7]研究發現，采用單因素結合Box-Behnken 響應面法提取的三葉木通總黃酮對DPPH自由基的清除率與維生素C接近，抗氧化活性作用較高。王振偉等[13]提取的線葉金雀花總黃酮作用于大腸桿菌后，大腸桿菌的生長對數期消失，細胞形態出現明顯損傷，抑菌效果顯著。龍林等[14]優化提取的青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

目前，提取黃酮的方法有酶解法、醇提法、水提法、超聲提取法、微波提取法等[15]，但單一提取方法效率較低。因此，本試驗結合醇提法和超聲法，在醇提的基礎上將超聲波提取作為提取手段，具有高效率、操作簡單、對設備要求低等優點。在單因素試驗基礎上，結合響應面法優化提取工藝，利用統計學試驗方法找出各因素水平的最佳條件[16]，得到多元二次回歸模型，計算出最優條件，優化工藝可靠，具有重復性。結果表明，試驗建立的方法不僅能夠提高總黃酮的含量，還可減少試驗成本，操作簡便，為辣蓼黃酮的研究及開發提供一定參考。

4 結論

本研究結果表明，優化后最佳工藝為料液比21 mL/g、乙醇含量62%、超聲時間39 min，超聲溫度40 ℃，此條件下制備的總黃酮平均含量為19.108%，提取工藝穩定，重現性良好。本試驗為辣蓼黃酮的提取提供了新思路，可為進一步研究發掘辣蓼黃酮的藥理作用及深入開發利用辣蓼黃酮提供理論依據和實踐參考，也可為其他植物中黃酮的提取提供有益參考。