基于微衛星標記的塔里木盆地5 個地區南疆沙蜥種群遺傳多樣性及遺傳結構分析

段嘉寶，農靜嫻，李孟純，楊天樂，李 鈾，2，3*

（ 1. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730100 ；2. 西北民族大學生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030 ；3. 西北民族大學生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030 ）

塔里木盆地深居亞歐大陸內部，位于青藏高原北部、帕米爾高原東部和天山南部，是中國面積最大的內陸盆地。塔里木盆地東西長1 500 km，南北寬約600 km，面積約530 000 km2，四周海拔高度在800～1 300 m 之間。盆地降水量少且蒸發量高，屬于典型的大陸性干旱氣候[1-2]。盆地因其獨特的地質地貌及環境屬性，孕育了豐富獨特的生物多樣性資源。南疆沙蜥（Phrynocephalus forsythii）隸屬于鬣蜥科（Agamidae）中的沙蜥屬（Phrynocephalus），是塔里木盆地特有爬行物種之一，是棲息于稀疏灌叢或戈壁灘的卵胎生蜥蜴。與同域分布的葉城沙蜥相比，南疆沙蜥更喜歡較為濕潤的棲息地[3]。

微衛星標記（simple sequence repeat，SSR）是基于DNA長度多態性的分子標記技術，可直接反映核酸水平的遺傳變異，廣泛應用于野生動物遺傳多樣性研究[4-6]。張沼等[7]利用8對微衛星分子標記對賽罕烏拉國家級自然保護區的馬鹿糞便樣品進行遺傳多樣性分析，表明該地區馬鹿種群的遺傳多樣性處于中上水平。張于光等[8]基于SSR對三江源和祁連山國家公園雪豹進行種群遺傳多樣性研究發現，野外生存雪豹種群遺傳多樣性相對較低，但祁連山國家公園雪豹種群遺傳多樣性相對較高，該研究成果對野生動物科學化保護提供了參考。目前學者多關注南疆沙蜥的系統進化關系及進化歷史的研究，群體遺傳結構的研究也在不斷完善[3,9]。本研究利用選取的4個微衛星位點，對塔里木盆地5個區域的南疆沙蜥的遺傳多樣性和遺傳結構進行探究，以期為塔里木地區南疆沙蜥的遺傳資源保護以及荒漠化地區其他物種的保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗研究對象為塔里木盆地5個地區（民豐、策勒、于田、和田、皮山）采集共計74個南疆沙蜥樣本，取肌肉與肝臟組織保存于無水乙醇與生理鹽水（體積比1∶1）組織保存液中，-20 ℃保存，用于后續分子試驗。塔里木盆地5個區域的南疆沙蜥樣本采樣點見表1。

表1 塔里木盆地5個區域的南疆沙蜥樣本采樣點Tab.1 Sampling point of P. forsythii samples in five regions of Tarim Basin

1.2 基因組DNA的提取

使用SteadyPure 通用型基因組DNA 提取試劑盒提取樣本的基因組DNA，并用1.4%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測DNA完整性及純度，保存-20 ℃。

1.3 引物設計及PCR擴增

參照已發表的沙蜥文獻中選取其中4個微衛星位點進行引物設計[10-11]，引物信息見表2。

表2 南疆沙蜥多態性微衛星位點信息Tab.2 Information of polymorphic microsatellite loci for P. forsythii

PCR 反應體系（12 μL）：5×buffer （Mg2+free）2.4 μL、TakapaHs 酶0.06 μL、tag F 0.09 μL、tag R 0.09 μL、Primers特異性引物2.4 μL、無菌水4.96 μL、DNA樣本含量2 μL。

PCR 擴增反應條件：95 ℃預變性10 min；92 ℃變性60 s，50 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，5 個循環；92 ℃變性30 s，63 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，20 個循環；92 ℃變性15 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40 個循環；72 ℃延伸10 min，25 ℃ 10 min。

擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上觀察結果。成功擴增的合格PCR 產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序分析，得到原始數據FASTA文件。

1.4 數據統計與分析

使用Genemarker[12]對測序儀得到的原始數據進行基因分型，分型后的數據使用MicroChecker 2.2.3[13]檢測是否存在無效等位基因。使用GenAlex V 6.5[14]分析等位基因數（number of allele，Na）、有效等位基因數（effective number of allele，Ne）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、近交系數（Fis）、Shannon 指數（I）、群體間Nei's 遺傳距離和遺傳相似度、群體間的遺傳分化指數（Fst）、基因流（Nm）和分子方差分析（AMOVA）。使用Cervus3.0[15]計算各位點的多態信息含量（PIC）。使用MEGA X[16]繪制基于群體間的Nei's 遺傳距離的UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類樹。主成分判別分析（discriminant analysis of principal components，DAPC）使用R中的“adegenet”包[17]。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性（見表3、表4）

表3 4個微衛星位點的遺傳多樣性Tab.3 Genetic parameters of four microsatellite loci

表4 5個南疆沙蜥種群在4個微衛星位點的遺傳多樣性參數Tab.4 Genetic diversity parameters at four microsatellite loci in five populations of P. forsythii

MicroChecker 檢驗微衛星基因分型數據，結果顯示，4個位點在5個群體均未檢出大量等位基因缺失或無效等位基因，因此選取的4個微衛星位點的基因分型數據可用于后續分析。4個多態性微衛星位點在5個群體內共檢測到98個等位基因。

由表3可知，各位點的平均Ho介于0.025～0.737之間，平均值為0.464。He 最低為0.250（Phr30），最高為0.886（Pvms20）。PIC介于0.375～0.950之間，平均值為0.788，其中PIC≥0.50 的高度多態性位點有3 個，分別為Phr79、Pvms20、Pvms38；0.25≤PIC≤0.50 的中度多態性位點有1 個，為Phr30。Fis和群體間的Fst分別介于0.327～0.900 和0.068～0.426。Nm 最低為0.337（Phr30），最高為3.418（Pvms20）。

由表4 可知，在5 個南疆沙蜥群體中，Na 和Ne 最多的為PS 群體，分別為11.500 和7.882，較少的為YT 和HT 群體，說明南疆沙蜥的5個群體的等位基因數存在一定差異。Na、Ho、He、PIC 等參數反映群體遺傳多樣性水平。根據5個群體的基礎遺傳參數表明，MF群體表現出比其他群體較高的雜合性且具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 群體遺傳分化水平（見表5、表6）

表5 南疆沙蜥種群遺傳變異的分子方差分析Tab.5 Analysis of molecular variance of population genetic variation of P. forsythii

表6 各群體間的遺傳分化指數Tab.6 Coefficient of population differentiation among populations

由表5 可知，5 個南疆沙蜥群體的遺傳變異主要來自群體內（92%），群體間的遺傳變異僅有8%，表明南疆沙蜥群體之間遺傳分化程度較小。

由表6可知，各群體間的Fst介于0.043（HT-PS）～0.191（MF-YT）之間，表明群體間存在中等程度的遺傳分化（Fst＜0.15）。此外，HT 群體與PS 群體的群體分化程度最小，為0.043，表明兩群體間較其他群體最有可能存在基因交流現象。

2.3 群體遺傳結構（見圖1、圖2）

圖1 基于Nei's遺傳距離構建的5個南疆沙蜥群體UPGMA聚類樹Fig.1 UPGMA clustering tree of five populations of P. forsythii based on Nei's genetic distance

圖2 南疆沙蜥的DAPC聚類圖Fig.2 DAPC cluster diagram of P. forsythii

由圖1 可知，5 個南疆沙蜥群體分為3 個聚類。其中CL和YT群體聚為一類，HT和PS群體聚為一類，MF群體單獨聚為一類。

由圖2 可知，MF 群體明顯區別于其他群體，CL 與YT群體混雜在一起，HT 與PS 群體混雜一起。DAPC 聚類結果與UPGMA聚類樹結果基本一致。

3 討論

3.1 南疆沙蜥的群體遺傳多樣性

遺傳多樣性對物種的生存和適應性具有重要影響，是物種進化演變的遺傳基礎。種群的遺傳多樣性水平越高，表明該群體適應環境變化的能力越強；反之，遺傳多樣性低下或下降很可能會導致物種的環境適應力和抵擋疾病的能力降低、雌雄性別比例失衡，甚至物種滅絕[18-19]。南疆沙蜥作為荒漠化地區的優勢物種，研究其遺傳多樣性對評估群體豐富度及其遺傳資源科學化保護尤為重要。本研究中，5 個南疆沙蜥群體在4 個微衛星位點上均檢測到Na 高于Ne，說明等位基因存在差異，分布不均勻，可能受到群體間潛在的近交現象影響。雜合性作為評估遺傳多樣性的重要遺傳參數，能夠較好地反映群體遺傳變異程度。本研究中，5個南疆沙蜥群體的Ho均低于He，表明遺傳多樣性水平較低，可能導致南疆沙蜥群體規模下降等潛在風險，但由于采集的樣本量不夠，有待進一步研究。

3.2 南疆沙蜥的遺傳分化

Fst的取值范圍0～1，最大值為1 表明兩個群體完全分化，最小值為0 表明群體間無分化。0＜Fst＜0.05 時，說明群體間遺傳分化很小，可忽略不計；0.05＜Fst＜0.15 時，表明群體間存在中等程度的遺傳分化；0.15＜Fst＜0.15 及Fst＞0.25時，表明群體間普遍存在較大及以上的遺傳分化[20-21]。本研究中，除CL-YT、CL-PS 及HT-PS 外，其余兩群體間均存在中等及以上的遺傳分化程度。總體來說，5 個南疆沙蜥的群體分化仍處于中等的遺傳分化水平，其群體間的差異較大。

3.3 南疆沙蜥群體遺傳結構

除了基于Nei's遺傳距離構建的UPGMA聚類樹外，基于DAPC 也是分析聚類關系的常用方法之一[22]。本研究中，UPGMA 聚類樹與DAPC 聚類圖中的聚類關系基本一致，均顯示MF群體明顯單獨聚為一類。MF群體與其他群體無混雜，可能與存在人為干擾等影響導致的基因交流屏障有關。在全球氣候變暖的背景下，對于變溫動物尤其是爬行動物的影響尤為顯著。因此，探究環境溫度對南疆沙蜥遺傳結構及適應性遺傳變異的影響，對棲息在塔里木盆地及少部分高原地區的南疆沙蜥而言，是否存在更大生存風險挑戰有待后續進一步研究加以驗證。

4 結論

本研究利用4個微衛星位點探究塔里木盆地5個區域的南疆沙蜥群體的遺傳多樣性及種群結構，發現5個南疆沙蜥群體在4 個微衛星位點的Ho、He 為0.464、0.692。多態信息含量均值為0.788，Fis及Fst均值分別為0.433、0.180。基于DAPC聚類分析結果顯示，MF群體單獨聚類為一支，與UPGMA 聚類樹結果一致。結果表明，5 個南疆沙蜥群體的遺傳多樣性水平低下，群體間存在較大的遺傳分化。

南疆沙蜥作為塔里木盆地內的爬行優勢物種，群體遺傳多樣性仍處于較低水平，群體分化水平受到人為因素和地質事件等多重影響，因而亟須加強對南疆沙蜥群體的保護。本試驗通過對塔里木盆地部分區域南疆沙蜥遺傳多樣性及種群結構進行研究，為南疆沙蜥的科學化保護提供參考意見，也為塔克拉瑪干沙漠等荒漠化地區物種保護提供一定參考。