陸地棉PUP家族基因的鑒定及表達分析

陳云，趙博雅，劉穎，王銘瑤，孟婷

（湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石 435002）

細胞分裂素（Cytokinin，CK）是一種重要的植物激素，它在植物的生長和發(fā)育過程中有著至關重要的作用，能夠促進細胞的分裂與分化[1-2]，控制芽的平衡和營養(yǎng)的轉導信號，提高作物產(chǎn)量[3]，形成頂端優(yōu)勢[4-5]，延遲衰老[6-7]以及對生物和非生物脅迫的響應[8-10]等。近年來，關于CK的合成與代謝途徑以及信號轉導途徑的研究取得了突破性的進展[11]。植物中天然存在的CK是腺嘌呤的衍生物，在腺嘌呤環(huán)上的第6位氮原子（N6）上通過共價鍵連接不同的側鏈形成腺嘌呤的衍生物[11-13]，根據(jù)側鏈的類型，CK可以分為異戊烯基型CK和芳香型CK，它們可以在植物體內的不同位置合成，然后經(jīng)過木質部或者韌皮部從莖運輸?shù)礁．愇煜┗虲K主要包括異戊烯基腺嘌呤（Isopentenyl adenine，iP）、順式玉米素(cis-zeatin，cZ)、反式玉米素(trans-zeatin，tZ)和二氫玉米素(Dihydrozeatin，DZ)[14]。其中，異戊烯基腺嘌呤和反式玉米素是植物中存在最廣泛的2種CK，比如擬南芥中既有異戊烯基腺嘌呤又有反式玉米素，而水稻和玉米中主要含有順式玉米素。芳香型的CK僅在較少的植物中發(fā)現(xiàn)，比如擬南芥、白楊。

在CK合成過程中有一個非常重要的基因，就是異戊烯基轉移酶基因（Isopentenyl transferase gene，ipt），其編碼的異戊烯基轉移酶是催化細胞分裂素合成的關鍵酶[15]，也是限速酶，但是該基因的表達具有組織和細胞特異性，因此，合成的CK需要通過特定的方式運輸?shù)狡渌慕M織或細胞中使用。在此過程中，一些起CK運輸作用的蛋白就非常重要。細胞分裂素通過木質部從根輸送到芽(主要以tZ型細胞分裂素形式)，通過韌皮部從芽輸送到根(主要以iP型細胞分裂素形式)[11，16-17]。目前的研究認為，核苷型CK是植物體內CK的主要轉運形式，其轉運蛋白分為濃縮型核苷轉運蛋白(Concentrative nucleoside transporters，CNTs)和平衡型核苷轉運蛋白（Equilibrative nucleoside transporters，ENTs）[18]。目前，關于植物中的CNT型轉運蛋白的研究報道較少，而ENT型轉運蛋白的研究報道較多。比如，擬南芥AtENT3和AtENT8已被證實具有轉運核苷型CK的能力[19]，OsENT2在水稻中也有潛在的轉運核苷型CK的能力[20]。除了上述2種類型的轉運蛋白之外，在擬南芥中，還發(fā)現(xiàn)了另一種稱為嘌呤滲透酶（Purine permeases，PUPs）的轉運蛋白，同樣在CK的運輸過程中發(fā)揮著重要的作用[21]，因為PUP蛋白對嘌呤具有很高的親和性，所以，在植物體中主要介導嘌呤或嘌呤類似物的運輸。而在早期GILLISSEN等[22]對擬南芥PUP家族基因的研究中發(fā)現(xiàn)，AtPUP1和AtPUP2是一類高親和質子耦合蛋白，可以通過高親和質子耦合轉運系統(tǒng)透過細胞膜，AtPUP1的主要作用是回收擬南芥葉片中的CK，AtPUP2的主要作用是介導維管及薄壁組織間CK的運輸，這些研究成果對PUP家族基因的功能及作用也提供了強有力的證據(jù)。此外，對水稻中OsPUP7基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因主要在未成熟的種子、胚乳以及幼穗中表達，其編碼的蛋白具有轉運CK的能力[23]。

棉花是最重要的纖維作物，也是重要的油料作物之一。因此，棉花在世界范圍內被廣泛種植。此外，棉花原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，并表現(xiàn)出一定程度的抗壓力[24]。然而，棉花經(jīng)常受到各種非生物脅迫（如干旱、高溫等），在其生長周期內，多種非生物脅迫會導致棉花產(chǎn)量下降或棉纖維質量變差。尤其當干旱脅迫超出棉花植物在生殖生長階段的自我保護能力時，不可避免地導致纖維產(chǎn)量和質量嚴重下降[25]。因此，提高棉花植株的抗旱性對世界農(nóng)業(yè)非常重要。PUP家族基因具有運輸CK的功能，CK在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成和逆境應答等方面具有重要作用。然而到目前為止，在陸地棉中尚未有PUP轉運基因的相關報道，對于陸地棉中PUP家族基因的數(shù)量和功能也未知。因此，利用生物信息學方法鑒定陸地棉中PUP基因對研究該家族在參與棉花抗逆中的功能角色具有重要的理論意義。

本研究利用生物信息學從陸地棉中鑒定PUP基因，并對PUP基因的結構、保守結構域、順式作用元件進行分析，同時了解PUP家族基因在脅迫條件下的表達模式，旨在為陸地棉抗旱研究提供候選基因。

1 材料和方法

1.1 基因序列的數(shù)據(jù)來源

擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtPUP家族基因的基因組序列從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫中獲取；水稻（Oryza sativa）OsPUP家族基因的基因組序列從RGAP（http://rice.plantbiology.msu.edu/）數(shù)據(jù)庫中獲取[14]；陸地棉的全基因組序列來自于GRAND（https://grand.cricaas.com.cn）數(shù)據(jù)庫，使用版本為“G.hirsutum_TM-1_HAU”。

1.2 陸地棉PUP家族基因的鑒定

利用已研究報道的擬南芥和水稻的PUP蛋白的氨基酸序列，通過BLAST陸地棉的全基因組數(shù)據(jù)庫，搜索基因組中的同源序列，從而獲得陸地棉的PUP基因候選序列，閾值為1e-10，取2次BLAST結果的交集。使用SMART工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）對候選陸地棉PUP蛋白序列進行驗證，獲得最終31個陸地棉PUP基因。通過在線網(wǎng)址ExPASy（https://www.expasy.org/），利用網(wǎng)址中的ProtParam工具，對陸地棉PUP蛋白的大小、分子質量、理論等電點及親水性等理化性質進行分析。

1.3 陸地棉PUP基因系統(tǒng)進化樹的構建

首先，通過MEGA 11軟件[23]對擬南芥、水稻和陸地棉的PUP蛋白進行多序列比對，然后運用相鄰鏈接法（Neighbor-Joining，NJ），模型選擇改序列組的最優(yōu)模型JTT，校驗參數(shù)Bootstrap設置為1000，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，從而對擬南芥、水稻、陸地棉PUP家族基因的進化關系進行分析，并進行亞族的分類。

1.4 陸地棉PUP基因的染色體定位與共線性分析

為了確定陸地棉PUP基因在染色體上的位置，可以通過植物全基因組數(shù)據(jù)庫GRAND（https://grand.cricaas.com.cn）中gff3文件中篩選出PUP基因位置信息，然后使用TBtools軟件[26]將PUP基因在染色體上的定位進行可視化。

再使用MCScanX軟件進行陸地棉全基因組范圍內的共線性分析，從分析結果中篩選出含有PUP基因的共線性區(qū)域及所有PUP基因的重復信息。利用TBtools中的Circos圖對位于染色體上的PUP基因進行位置與共線性關系的展示。

1.5 陸地棉PUP基因的結構及蛋白質保守結構域分析

從陸地棉基因組gff3文件中篩選出PUP基因結構信息；利用MEME（Multiple expectation maximization for elicition）網(wǎng)站對陸地棉PUP蛋白進行保守結構域預測，motif sites設置為2～500 sites，Width在6～100 wide；總共識別獲得10個不同的motif，并下載預測得出的xml格式文件，利用TB-tools[26]工具將結果進行可視化。

1.6 Ka(nonsynonymous)/Ks(synonymous)分析

利用Tbtools中的Simple Ka/Ks Calculator（NG）程序來計算水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、陸地棉（Gossypium hirsutum）的同源PUP基因的Ka、Ks、Ka/Ks。

1.7 順式作用元件分析

利用TBtools軟件從陸地棉基因組數(shù)據(jù)中提取出GhPUP基因起始密碼子(ATG)上游2 000 bp的啟動子序列；在PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站上進行啟動子順式元件分析；利用“Simple BioSequence Viewer“程序，在TBtools上進行順式作用元件可視化。

1.8 陸地棉PUP基因表達分析

從CottonMD（http://yanglab.hzau.edu.cn/CottonMD/）數(shù)據(jù)庫中提取出PUP家族基因成員的組織表達和不同脅迫條件下的轉錄組數(shù)據(jù)，然后運行TBtools軟件中的Amazing Heatmap程序，設置列相標準化和橫相聚類，對陸地棉PUP基因在不同組織以及不同處理條件下的表達情況進行分析與可視化。

2 結果與分析

2.1 陸地棉PUP家族基因的鑒定

結合擬南芥和水稻的PUP基因，利用BLAST方法，在陸地棉的全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定OsPUP和AtPUP的同源序列，通過篩選最終獲得31個陸地棉PUP基因，根據(jù)基因位于染色體位置依次命名為GhPUP1～GhPUP31。使用ExPASy工具對這31個蛋白的分子質量、等電點、基因編號、蛋白長度和在染色體的位置等進行了分析，具體結果如表1所示，這些PUP基因編碼的蛋白質氨基酸數(shù)在168（GhPUP3）～472個（GhPUP27），分子質量的大小在18 374.78～52 935.23 u。GhPUP蛋白家族成員中理論等電點最大的是GhPUP5蛋白，等電點為9.17，而最小的是GhPUP9蛋白，等電點為6.30，且這31個蛋白均為疏水性蛋白。

表1 陸地棉PUP家族基因信息Tab.1 Information of PUP family genes in Gossypium hirsutum

2.2 陸地棉PUP基因的系統(tǒng)進化分析

為了研究陸地棉PUP家族基因的起源和進化，根據(jù)31個陸地棉GhPUP家族成員的蛋白序列、20個擬南芥AtPUP家族成員的蛋白序列和12個水稻OsPUP家族成員的蛋白序列，然后利用MEGA 11軟件構建了PUP蛋白在水稻、擬南芥和陸地棉之間的系統(tǒng)進化樹，結果如圖1所示。

圖1 陸地棉、水稻和擬南芥PUP蛋白系統(tǒng)進化關系Fig.1 Phylogenetic relationship of PUP proteins in Gossypium hirsutum，Oryza sativa，and Arabidopsis

由圖1可知，63個PUP基因被分成了4個分支，分別命名為Group1～Group4。其中，陸地棉PUP保守域序列在各個分支中的具體分布情況為：Group1亞家族中共有15個；Group2亞家族中共有12個；Group3亞家族有4個；Group4亞家族中沒有陸地棉PUP。通過比較這4個亞家族，可觀察到Group1成員最多，且涵蓋3個物種；Group2、Group3成員數(shù)目逐漸降低，但均涵蓋3個物種；Group4只有1個AtPUP成員，可能由于該基因在進化的過程中不保守，蛋白序列差異較大，可能行使特別的功能。

2.3 陸地棉PUP基因結構及保守結構域分析

為了進一步了解陸地棉PUP基因的功能，單獨使用陸地棉PUP蛋白進行了系統(tǒng)進化分析，并利用MEME、NCBI-CDD、TBtools等軟件對這31個陸地棉PUP蛋白的基因結構和保守結構域進行了分析，結果如圖2所示，單獨使用陸地棉PUP蛋白構建的進化樹與使用陸地棉、水稻和擬南芥PUP蛋白構建的進化樹的分支情況存在一定的差異，單獨使用陸地棉PUP蛋白構建的進化樹將31個蛋白分成3支。第1支有16個成員（GhPUP6、GhPUP18、GhPUP19、GhPUP23、GhPUP22等），第2支只有2個成員（GhPUP8、GhPUP25），第3支包含13個成員（GhPUP9、GhPUP26、GhPUP30等）。基因結構的分析結果顯示，這些陸地棉PUP基因大多數(shù)只有1個內含子，少數(shù)有2個（GhPUP5、GhPUP24、GhPUP28）或3個內含子(GhPUP31)，也有少數(shù)基因沒有內含子(GhPUP2、GhPUP3、GhPUP4、GhPUP17、GhPUP18)。保守結構域的分析結果顯示，除了motif 9外（只有11個基因包含motif 9），大多數(shù)基因都包含motif 1～motif 10。GhPUP8和GhPUP25不含motif 5、motif 7和motif 9。GhPUP14和GhPUP31不含motif 5和motif 9。GhPUP3這個基因所含的motif數(shù)量最少，只有4個。

圖2 GhPUP蛋白進化樹、基因結構及保守結構域分析Fig.2 The phylogenetic tree，gene structure，and conserved domain analyses of the GhPUP protein

2.4 陸地棉PUP基因在染色體上的定位與基因復制分析

由于基因在染色體上的分布在一定程度上影響了基因的功能，因此，對這31個GhPUP基因在染色體上的定位進行了分析（圖3）。結果顯示，31個GhPUP基因分布在19條染色體上，圖中及下文只涉及有GhPUP分布的染色體。Ghir_D05染色體上的PUP基因最多，為4個；其他染色體均有1～2個PUP基因的分布。從結果可以看出，少數(shù)基因存在基因成簇現(xiàn)象，比如GhPUP6/7位于Ghir_A05染色體的相近位置，GhPUP15/16位于Ghir_D01染色體的相近位置，GhPUP22/23/24位于Ghir_D05染色體的相近位置。

圖3 陸地棉PUP基因在染色體上的分布Fig.3 Chromosomal distribution of PUP genes in Gossypium hirsutum

復制事件在植物進化過程中起著至關重要的作用，串聯(lián)復制和片段復制是導致基因組擴增和復雜性增加的重要過程[27-28]。對31個陸地棉PUP基因的基因重復現(xiàn)象進行了分析，如圖4所示，陸地棉基因組中共有17個同源性的PUP基因對，涉及25個PUP基因，其中一對一重復的基因對有8個，一對多的基因對有3個，比如GhPUP21分別與GhPUP26及GhPUP27在2個不同的共線區(qū)域表現(xiàn)為重復基因。GhPUP基因的復制類型基本上都是片段重復，沒有同一條染色體多個同源PUP基因成簇的現(xiàn)象出現(xiàn)。

圖4 PUP基因在陸地棉基因組中的基因復制事件Fig.4 Gene replication events of PUP genes in Gossypium hirsutum genome

2.5 擬南芥、水稻、陸地棉PUP基因共線性分析

為了探究擬南芥、水稻、陸地棉中的PUP家族基因的進化關系，通過MCScanX軟件對3個物種中的PUP基因進行了共線性分析。從圖5可以看出，與擬南芥和水稻具有共線性的基因對分別有3、4個，說明陸地棉與這2個物種的PUP基因同源性較低。

圖5 不同物種PUP基因共線性分析Fig.5 Collinearity analysis of PUP genes in different species

2.6 擬南芥、水稻、陸地棉PUP家族基因的遺傳變異分析

Ka/Ks表示的是非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks）之間的比例，這一比值可以推斷編碼該蛋白的基因是否遭受了選擇壓力[29]。Ka為非同義替換率，表示在進化過程中堿基的變化會改變蛋白的編碼；Ks為同義替換率，表示因密碼子簡并性的存在，在進化過程中堿基的突變不會改變最終蛋白的編碼。如果Ka/Ks＜1則表示凈化選擇，Ka/Ks＞1表示正向選擇，Ka/Ks=1為中性選擇[29]。為了進一步了解陸地棉PUP基因在分化中選擇壓力的程度，對24個同源基因對的非同義（Ka）和同義（Ks）值進行了評估。表2展示了所有與陸地棉PUP同源的PUP基因對之間的Ka和Ks，因個別基因對最終的計算數(shù)值為NA，故沒有展示出來。由表2可知，所有可計算的PUP基因對的Ka/Ks均小于1，且有些基因對的數(shù)值遠小于1，比如第一組值為0.165，說明在這3個物種的進化過程中PUP基因受自然選擇的方式為凈化選擇，PUP基因在進化過程中功能保守。

2.7 陸地棉PUP順式作用元件分析

順式作用元件是特定轉錄因子的結合位點，它決定轉錄的起始或抑制。因此，這些順式作用元件是基因組中必不可少的基因結構。因此，為進一步了解GhPUP蛋白的潛在功能與調控作用，通過PlantCARE和TBtools對基因上游2 000 bp的序列中的順式作用元件進行了篩選和分析。每個GhPUP基因至少含有5個順式作用元件，一共有18個元件出現(xiàn)在GhPUP啟動子區(qū)域（圖6，不同的色框代表不同的元件）。這些元件可分為3類，分別是激素應答、脅迫/物理應答以及與植物生長發(fā)育相關的元件。比如，CGTCA-motif參與應答MeJA信號通路。結合左邊的進化樹可知，分在同一組的GhPUP成員有著較為相似的順式作用元件種類與數(shù)目，例如，GhPUP6和GhPUP22都有CAT-box。幾乎每個成員都有ARE這個元件，但同時每個成員也有其不同于其他成員的特殊元件，比如GhPUP21有GARE-motif，而其他成員少有。

2.8 陸地棉PUP基因的表達模式分析

2.8.1 陸地棉PUP基因在不同組織中表達模式分析 為了研究PUP基因在陸地棉不同組織中的表達模式，從陸地棉基因表達芯片中篩選出了25個PUP基因的組織表達數(shù)據(jù)。利用TBtools軟件中的Heatmap程序將GhPUP基因在不同組織（根、莖、葉、花瓣、花藥、苞片、雌蕊、萼片、花托以及開花前后不同天數(shù)的纖維和胚珠）中的表達情況進行了分析。圖7是PUP基因在根、莖、葉、花瓣、花藥、苞片、雌蕊、萼片、花托中的表達圖譜，結果顯示，依據(jù)組織表達情況，這25個PUP基因可以分為8支（圖7）。第1支包含4個基因，這4個基因主要在花器官中表達，其中，GhPUP10基因主要在花瓣、花藥、苞片、雌蕊和萼片中表達，GhPUP12和GhPUP29基因在花藥中有較高表達，GhPUP14基因在苞片、萼片和花托中有一定的表達。第2支包含2個基因（GhPUP5和GhPUP20），這2個基因在根、莖和花托中表達量較高。第3支和第4支都只有1個基因，分別是GhPUP25和GhPUP22，它們分別在葉和花瓣中優(yōu)勢表達。第5、6、7支總共包含15個基因，這15個基因在各組織中的表達量都比較低。第8支中的2個基因在莖中有一定的表達，在其他組織中的表達量很低。

同時對以上25個基因在不同發(fā)育時期的棉纖維和胚珠中表達情況也進行了分析，結果如圖8所示，依據(jù)表達情況，它們分為6支。處于相同支的基因表達模式較為一致。第1支只有GhPUP17這1個基因，該基因在開花前3 d到開花后10 d的胚珠中優(yōu)勢表達；第2支中的GhPUP1和GhPUP15這2個基因僅在開花后15 d的胚珠中表達量較高，在其他時期的纖維和胚珠中的表達量均較低。第3支中也只有1個基因（GhPUP2），該基因在纖維和胚珠中的表達量都很低，僅在開花前3 d到開花后10 d的胚珠中有少量表達。第4支包含15個基因，這15個基因在纖維和胚珠中幾乎沒有表達。第5支包含4個基因，其中，GhPUP9在開花后25 d的胚珠中優(yōu)勢表達，GhPUP14基因在開花前3 d到開花后20 d的胚珠中有一定的表達，GhPUP5和GhPUP20基因在開花后20 d的胚珠中的表達量相對較高。第6支中的2個基因均在纖維中優(yōu)勢表達，其中，GhPUP22在開花后10、15 d的纖維中優(yōu)勢表達，而GhPUP29在開花后20、25 d的纖維中優(yōu)勢表達。以上結果表明，陸地棉PUP基因的組織表達模式各不相同，暗示了各個成員在不同的組織器官中發(fā)揮功能。

圖8 陸地棉PUP基因在不同發(fā)育時期纖維和胚珠中表達圖譜Fig.8 Expression profiles of PUP genes in Gossypium hirsutum in fibers and ovules at different developmental stages

2.8.2 不同脅迫處理下陸地棉PUP基因的表達模式分析 為了研究陸地棉PUP基因在幼苗期對脅迫（如冷、熱、干旱等）的應答，對陸地棉幼苗在4 ℃低溫、37 ℃高溫、PEG、NaCl處理條件下，處理時間為1、3、6、12、24 h的轉錄組數(shù)據(jù)進行了分析，結果表明，依據(jù)這些PUP基因在幼苗期對各種脅迫的應答可以將其分為5類（圖9）。第1類只包含GhPUP22基因，該基因在正常生長條件下隨著時間的增加其表達量呈先升高后降低的模式；而在低溫、高溫以及NaCl處理條件下，該基因的表達基本上都受到強烈的誘導，只有PEG處理后其表達呈現(xiàn)先升高后降低的模式。第2類的3個基因（GhPUP16/9/25）在PEG和NaCl處理條件下受到一定的誘導表達，在低溫和高溫處理條件下表達變化不顯著。第3類至第5類的基因表達基本上不受脅迫處理的誘導，整體表達水平都比較低，其中，GhPUP13、GhPUP29、GhPUP10基因在37 ℃處理1 h時表達量受到顯著誘導，但隨著處理時間的增加表達量也降低。以上結果暗示了GhPUP22/16/9/25/13/29/10這7個基因可能參與了陸地棉脅迫防御應答。

圖9 不同脅迫處理下陸地棉PUP基因的表達分析Fig.9 Expression analysis of PUP genes in Gossypium hirsutum under different treatment conditions

3 結論與討論

CK對于植物的生長發(fā)育起著至關重要的作用，近些年來，隨著對CK的研究不斷深入，已經(jīng)證實了3個可以運輸CK的基因家族，分別是ENT基因家族、PUP基因家族和CNT基因家族，前2個轉運基因家族在擬南芥中均有報道（AtENT被CHEN等[30]報道過，AtPUP被CEDZICH等[31]報道過）。目前關于植物中PUP家族基因的研究較少，僅在擬南芥、水稻和玉米中有相關研究報道，其他物種中尚未見PUP家族基因的數(shù)量和功能的研究報道。

本研究運用生物信息學方法，從陸地棉TM-1中鑒定了31個PUP家族基因。依據(jù)擬南芥和水稻PUP蛋白的分類，陸地棉31個PUP蛋白被分為三大類，說明這3類中的陸地棉PUP基因的結構與功能與共處同一大類的擬南芥或水稻的PUP基因類似。3個物種的PUP蛋白被分為4支，其中，AtPUP9因無法融入樹中被單獨劃為1支。基因的復制模式通常揭示了基因是如何產(chǎn)生的，它的功能是如何進化的，以及它在植物生長和發(fā)育中可能扮演的角色[32]。本研究結果顯示，陸地棉PUP基因的復制類型為片段復制，說明GhPUP基因可能在遠古時期就已經(jīng)存在[33]。通過片段復制產(chǎn)生的新基因通常會提高植物對各種生長條件的適應能力，這表明GhPUP基因對陸地棉的生長發(fā)育是不可或缺的[34-35]。同時，所有的GhPUP同源基因對的Ka/Ks值都小于1，說明PUP基因的進化較為保守和緩慢[35]。順式作用元件分析結果顯示，所有GhPUP基因的啟動子上均有ARE元件（厭氧誘導所必需的順式作用調節(jié)元件），且有17個GhPUP基因的啟動子上包含ABRE元件，說明大多數(shù)的GhPUP基因參與陸地棉對非生物脅迫的應答。

目前關于PUP家族基因在細胞分裂素的運輸中的研究報道較少，現(xiàn)已知的是AtPUP1和AtPUP2在酵母體中被證明為CK轉運蛋白，AtPUP3在酵母中沒有檢測到轉運活性[14]。關于PUP家族基因在植物抗逆中的研究也尚未見報道。因此，為了研究陸地棉PUP基因在抗逆中的功能，本研究利用網(wǎng)上公開的轉錄組數(shù)據(jù)庫對GhPUP基因的組織表達模式以及在不同脅迫處理條件下的表達模式進行了分析，結果表明，GhPUP基因有各自特異的時空表達性，在不同發(fā)育時期的組織中表達模式不同。每一種組織中都有對應高表達的GhPUP，比如在根和莖中GhPUP22的表達量最高，GhPUP5次之；GhPUP25和GhPUP22分別在陸地棉葉片和花瓣中優(yōu)勢表達。從逆境脅迫處理下的表達情況來看，GhPUP22在各種處理條件下，表達量都高于對照組，且其表達量隨著脅迫處理時間的增加而增加。GhPUP25在PEG處理12、24 h以及NaCl處理6、12 h時表達量都要高于對照組，且該基因在葉片中優(yōu)勢表達，葉是植物進行光合作用和蒸騰作用的重要器官，而氣孔的功能是控制植物體內的氣體交換和調節(jié)水分平衡，植物在遭受干旱脅迫時，往往通過調節(jié)氣孔關閉來減少水分的流失[23]，暗示了該基因可能參與了陸地棉對干旱和鹽脅迫的應答。GhPUP16基因的表達模式同GhPUP25基因，在葉片中表達量相對較高，在其他組織中幾乎檢測不到，但是在PEG和NaCl處理后其表達量受到誘導。此外，GhPUP13、GhPUP29、GhPUP10這3個基因在37 ℃處理1 h后，它們的表達量受到顯著誘導，說明它們響應了陸地棉對熱脅迫的應答。因此，根據(jù)試驗結果，猜測GhPUP22/16/9/25/13/29/10這7個基因可能參與了陸地棉脅迫防御應答。這些PUP基因在陸地棉抗逆中的功能還有待進一步研究。

本研究首次完成了陸地棉PUP家族基因的鑒定及表達分析工作，并篩選出了參與陸地棉脅迫應答的PUP基因，可為后續(xù)的基因功能研究提供候選目標。