葡萄VvWRKY70基因生物信息學(xué)及表達特性分析

李晉圓 ，李莉娟 ，宋晶晶 ，閆冬梅 ，董志剛 ，儀慧蘭

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 果樹研究所，山西 太谷 030800）

WRKY基因組成了植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，編碼蛋白具有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，參與植物生長發(fā)育、物質(zhì)代謝及非生物（紫外線、低溫、H2O2等）和生物（病原菌）脅迫應(yīng)答[1-2]，是植物天然免疫系統(tǒng)的核心成員。近年來，隨著植物基因組測序結(jié)果的公布，很多物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族被預(yù)測和鑒定，不同物種中WRKY家族擁有的成員數(shù)量差異較大，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有74個[3]，蘋果（Malus sieversii）中有127個[4]，水稻（Oryza sativa）中有102個[5]等。根據(jù)N端WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)目和C端鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被分為3類，第Ⅰ類通常含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，第Ⅱ類和第Ⅲ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，C端鋅指結(jié)構(gòu)第Ⅱ類為C2H2型，第Ⅲ類為C2HC型[6]。WRKY蛋白可通過特異性結(jié)合啟動子區(qū)Wbox（TTGACT/C）順式作用元件而激活或抑制下游靶基因的表達[7]，也可與其他蛋白形成復(fù)合體，使轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合活性增強或抑制[8]。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可受激酶調(diào)控，參與植物對病原菌的響應(yīng)[8]。

值得注意的是，部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子已被證明在果實軟化和生物脅迫中發(fā)揮重要作用。研究表明，野生草莓FvWRKY48可增加果膠裂解酶基因FvPLA的表達，促進細胞壁中果膠質(zhì)的裂解，加速果實軟化[9]；FaWRKY25通過負調(diào)控茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)草莓果實對灰霉菌的抗性[10]。擬南芥AtWRKY70參與水楊酸（SA）和茉莉酸防御信號途徑[11]，調(diào)控抗病基因（R）介導(dǎo)的抗性、系統(tǒng)防御應(yīng)答和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等過程[12-13]；番茄SlWRKY70能激活抗病基因Mi-1的表達，增強對線蟲和蚜蟲的抗性[14]，小麥TaWRKY70可激活水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)植株對條銹菌的抗性[15]。

葡萄作為全球廣泛種植的果樹作物，具有重要的經(jīng)濟價值，但鮮食葡萄保鮮機制尚不清楚，影響和限制了葡萄的保鮮處理。依據(jù)WRKY家族的分子特征，在葡萄基因組中共預(yù)測到59個WRKY家族成員[16]，但僅有17個VvWRKYs功能被研究[17-20]，其中VvWRKY1、VvWRKY2、VvWRKY33和VvWRKY52等6個WRKYs轉(zhuǎn)錄因子通過同源或異源過表達的方式被證實在植株應(yīng)對生物脅迫過程中發(fā)揮調(diào)控作用[17,19,21-22]。

課題組前期在SO2保鮮60 d的玫瑰香葡萄果實轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了差異表達的17個葡萄WRKYs（VvWRKYs）基因，基于AtWRKY70在植物免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用[11-13]，將其中編碼蛋白與AtWRKY70序列同源性相似度最高的一個基因暫命名為VvWRKY70。本研究運用生物信息學(xué)技術(shù)對VvWRKY70啟動子及其編碼蛋白質(zhì)的性能進行預(yù)測，并對其轉(zhuǎn)錄特征進行分析，旨在為深入研究VvWRKY70的生物學(xué)功能及其在鮮食葡萄保鮮中的作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

葡萄材料取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所（山西，太谷）。選商用成熟玫瑰香（Vitis viniferaL.cv. Muscat）葡萄果穗，采用二氧化硫（SO2）結(jié)合低溫（0 ℃）的方式保鮮，對照組處于相同條件只是不加SO2保鮮劑[23]。取SO2保鮮60 d果實和同期對照組果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，找出差異表達的VvWRKY基因，將編碼蛋白與擬南芥AtWRKY70氨基酸序列同源性最高的1個基因暫命名為VvWRKY70，該基因登錄號為LOC100255013，編碼蛋白質(zhì)序列登錄號為XP_002272504.1。

取玫瑰香葡萄藤條上的根、莖、幼葉、成熟葉、花蕾、幼果及成熟果實的果皮和果肉，用于RNA提取。選色澤接近的成熟果穗分組，分別進行SO2保鮮處理[23]，低溫（0 ℃）和灰霉菌孢子（5.0×106cfu/mL）噴施處理。處理一定時間后，隨機選取果粒，用純凈水沖洗，剝?nèi)」ひ旱賰龊笥?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析方法 使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析基因VvWRKY70啟動子區(qū)順式作用元件；在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析VvWRKY70蛋白的理化性質(zhì)；用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析VvWRKY70氨基酸序列的疏水性/親水性，NetPhos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/）預(yù)測VvWRKY70蛋白磷酸化位點，SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測VvWRKY70二級結(jié)構(gòu)，Conserved Domains（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure /cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測VvWRKY70保守結(jié)構(gòu)域，SWISS-MODEL預(yù)測VvWRKY70三級結(jié)構(gòu)，WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測VvWRKY70亞細胞定位。Bioedit軟件分析VvWRKY70及其同源蛋白氨基酸序列特征，軟件MEGA7.0的N-J法構(gòu)建VvWRKY70進化樹（bootstrapped=1 000），用到的GenBank登錄號如下：擬南芥AtWRKY70（NP_191199.1）、大麥HvRGA5-like（XP_044984274.1）、水稻OsWRKY70（XP_015638920.1）、小麥TaWRKY70（XP_044377883.1）、玉米Zm-unknown（ACF 82210.1）、高粱SbWRKY54（XP_002460069.1）、二穗短柄草BdWRKY70（XP_010228655.1）、大豆GmWRKY70（XP_006599732.1）、番茄SlWRKY80（NP_001352740.1）、苜蓿MtWRKY70（XP_003623 634.1）、毛果楊PtWRKY70（XP_002309186.3）、蓖麻RcWRKY70（XP_002528697.1）、萊茵哈德衣藻CrCHLRE（XP_042925408.1）、翠柏氏藻TrWRKY（KAA6429813.1）、小立碗蘚 PpWRKY33（XP_024358453.1）。

1.2.2 基于qRT-PCR的VvWRKY70表達分析葡萄RNA提取采用改良CTAB法[24]，使用Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第1鏈，之后用SYBR Premix Ex TaqTMII PCR Kit進行qRT-PCR檢測，引物序列如表1所示。每個反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)，以Vvactin7為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計算VvWRKY70的相對表達量。

表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS對檢測結(jié)果進行方差分析；采用Duncan法分析多組樣本間的差異顯著性，t檢驗分析處理組與對照組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvWRKY70基因啟動子區(qū)的順式作用元件

提取VvWRKY70CDS上游2 000 bp序列進行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)VvWRKY70基因啟動子區(qū)除含有W-box元件外，還含有水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脫落酸（ABA）等與植物防御相關(guān)的響應(yīng)元件，以及響應(yīng)干旱的MYB結(jié)合位點（MBS）（圖1），說明VvWRKY70轉(zhuǎn)錄因子可能在植物防御應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，參與植株對生物和非生物脅迫的應(yīng)答。

圖1 VvWRKY70基因啟動子區(qū)順式作用元件Fig.1 Cis-acting elements in the promoter region of VvWRKY70

2.2 VvWRKY70蛋白的理化性質(zhì)

2.2.1 葡萄VvWRKY70蛋白的基本性質(zhì) 用Ex-PASyProtParam對葡萄VvWRKY70蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示（圖2），VvWRKY70共有322個氨基酸，絲氨酸（Ser）含量最豐富，占總量的14.0%，其次是天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和蘇氨酸（Thr），分別占7.8%、7.1%和6.8%；半胱氨酸（Cys）、脯氨酸（Pro）和色氨酸（Trp）含量較少，分別占2.5%、2.2%和1.2%；帶正電荷的氨基酸（His+Arg+Lys）總數(shù)為47，帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）總數(shù)為47。其理論分子質(zhì)量約為36.57 ku，理論等電點為5.49。不穩(wěn)定系數(shù)為66.07（＞40.00），推測為不穩(wěn)定蛋白。

圖2 VvWRKY70的氨基酸組成分布Fig.2 Amino acid composition distribution of VvWRKY70

2.2.2 葡萄VvWRKY70氨基酸序列的疏/親水性預(yù)測 了解蛋白質(zhì)的疏水性/親水性對其高級結(jié)構(gòu)的形成和功能預(yù)測具有參考價值。利用軟件ProtScal，根據(jù)Kyte & Doolittle算法[25]預(yù)測（滑窗=9），在VvWRKY70蛋白中親水氨基酸在整個蛋白分子中都有分布，約占氨基酸總量的79.9%，明顯多于疏水氨基酸（圖3），推測VvWRKY70為親水性蛋白。同時使用ProtParam工具預(yù)測到該蛋白平均親水指數(shù)為-0.907，屬于親水蛋白，預(yù)測結(jié)果與ProtScal一致。VvWRKY70具有一定數(shù)量的疏水氨基酸，這有利于其通過疏水作用形成疏水核心，被親水組分包圍，形成一定的空間構(gòu)象。

圖3 VvWRKY70的疏水性/親水性預(yù)測結(jié)果Fig.3 Hydrophobic and hydrophilic prediction of VvWRKY70

2.3 葡萄VvWRKY70蛋白磷酸化位點預(yù)測

細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。利用在線工具NetPhos3.1（得分大于0.5為可能的磷酸化位點）分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），VvWRKY70可能存在多個絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化位點，其中Ser、Thr和Tyr磷酸化位點分別有34、10、4個，由此推測，VvWRKY70的激活可能與蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)，受細胞激酶信號的調(diào)節(jié)。

圖4 預(yù)測的VvWRKY70磷酸化位點Fig.4 Predicted phosphorylation sites of VvWRKY70

2.4 葡萄VvWRKY70的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SPOMA預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），葡萄VvWRKY70二級結(jié)構(gòu)包含無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊片層和β-轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)，分別占蛋白分子的62.73%、22.98%、10.87%和3.42%，其中，無規(guī)卷曲是VvWRKY70的主要二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋和β-折疊片層結(jié)構(gòu)散在分布于整個肽鏈中。

圖5 預(yù)測的VvWRKY70二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Predicted secondary structure of VvWRKY70

2.5 葡萄VvWRKY70的結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位預(yù)測

對葡萄VvWRKY70進行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其第135—195位氨基酸是典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域（圖6-A）。SWISS-MODEL軟件預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，第135—195位氨基酸可形成特定的高級結(jié)構(gòu)（圖6-B）。

圖6 VvWRKY70的保守結(jié)構(gòu)域及其高級結(jié)構(gòu)Fig.6 VvWRKY70 protein conservative domain and its advanced structure

WoLF PSORT預(yù)測顯示，VvWRKY70定位于細胞核中的預(yù)測值為13，在細胞質(zhì)中的預(yù)測值為1，初步推測VvWRKY70可能位于細胞核中，這與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的場所吻合。

2.6 VvWRKY70的系統(tǒng)進化樹分析與功能預(yù)測

BlastP工具檢索到與VvWRKY70序列同源性較高的16種植物（分別屬于苔蘚、地衣、蕨類、單子葉植物和雙子葉植物）的WRKY家族成員；利用BioEdit軟件分析比較氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)VvWRKY70蛋白的氨基酸序列N端含有一個保守的WRKYGQK序列，C端含有C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)（圖7-A），屬于WRKY第Ⅲ亞家族。使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建VvWRKY70系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹中雙子葉和單子葉植物分別聚成一支，而低等植物分支較遠，屬于遠源物種，這與植物物種進化過程一致，說明VvWRKY70在進化上趨于保守（圖7-B），在植物中可能發(fā)揮著基礎(chǔ)的生物學(xué)功能。通過類比其他物種同源性相近的WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能（表2），預(yù)測VvWRKY70可能在植物響應(yīng)非生物脅迫和病原真菌侵染中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

圖7 VvWRKY70氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Analysis of amino acid sequence and phylogenetic tree of VvWRKY70

表2 不同物種中與VvWRKY70相似性較高的蛋白質(zhì)的功能描述Tab.2 Functional description of proteins with high similarity to VvWRKY70 in different species

2.7 VvWRKY70組織表達模式及在葡萄果實中的誘導(dǎo)表達分析

RT-PCR發(fā)現(xiàn)，VvWRKY70在玫瑰香葡萄的根、莖、幼葉、成熟葉、花蕾、幼果及成熟果實的果皮和果肉中均有表達（圖8-A），成熟葉中表達量最高。

圖8 VvWRKY70的組織表達模式及脅迫應(yīng)答Fig.8 Tissue expression pattern and stress response of VvWRKY70

選取與葡萄保鮮過程密切相關(guān)的3個環(huán)境因子低溫、灰霉菌和SO2保鮮處理葡萄果實，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫處理后，相比于同期對照組，VvWRKY70顯著下調(diào)表達（圖8-B）；而SO2保鮮和灰霉菌處理組相比于同期對照組葡萄果皮中VvWRKY70上調(diào)表達（圖8-C、D）。說明在采后保鮮過程中葡萄果實VvWRKY70被誘導(dǎo)表達，可能對葡萄采后保鮮發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與討論

植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)節(jié)蛋白超家族，通過與MAPK和VQ蛋白等聯(lián)合作用形成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)著植物對不同環(huán)境刺激的響應(yīng)[1，8]。在葡萄（Vitis vinifera）中，基于公布的12×V. viniferacv.黑比諾（PN40024）基因組序列，預(yù)測出59個可能的VvWRKYs轉(zhuǎn)錄因子[16]，但僅有少數(shù)VvWRKYs轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能通過異源過表達擬南芥、煙草植株或瞬時轉(zhuǎn)化葡萄葉片等手段得到證明，如VvWRKY1、VvWRKY2和VvWRKY33轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對灰霉菌、霜霉菌等病原菌侵染時發(fā)揮正調(diào)控作用[17,21-22]；VvWRKY22和VvWRKY26轉(zhuǎn)錄因子參與糖類和類黃酮的生物合成[31-32]；轉(zhuǎn)錄因子VvWRKY8、VvWRKY11和VvWRKY30正調(diào)控植株對紫外線、干旱和鹽脅迫的應(yīng)答[18,33-34]。受葡萄遺傳轉(zhuǎn)化困難的限制，葡萄WRKY家族中僅有VvWRKY1、VvWRKY52、VvWRKY8等少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子被證明在葡萄植株抵御營養(yǎng)型病原菌白粉菌和非生物脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用[19,33]，VvWRKY70的功能尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析和基因轉(zhuǎn)錄分析，獲得了玫瑰香葡萄VvWRKY70的基本特征，為進一步揭示VvWRKY70的功能奠定了基礎(chǔ)。

有研究證明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化在植物免疫中發(fā)揮重要的作用，如擬南芥AtWRKY70的Thr22和Ser34位點的磷酸化可激活SARD1表達，增強植株對丁香假單胞菌（PstDC3000）的抗性[35]，AtWRKY33磷酸化能激活A(yù)tPAD3的表達，介導(dǎo)抗毒素生物合成，增強植物對灰霉菌的抗性[36]。由于VvWRKY70氨基酸序列與AtWRKY70具有較高的同源性，且可能存在多個絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化位點，可能受激酶磷酸化的調(diào)控。

功能性W-box元件主要存在于WRKY基因的啟動子區(qū)[36]，因此，WRKY蛋白可以與自己或其他WRKY基因的啟動子區(qū)結(jié)合以進行自我或交叉調(diào)節(jié)，如水稻OsWRKY70、辣椒CaWRKY40能夠結(jié)合自己的W-box實現(xiàn)自激活響應(yīng)病原菌和熱脅迫[37-38]。VvWRKY70基因的啟動子區(qū)域具有W-box順式作用元件，說明VvWRKY70可能會受到自身或者其他VvWRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在VvWRKY70的啟動子區(qū)，除了W-box元件外，還有SA、MeJA、和ABA等激素響應(yīng)元件。SA和MeJA是植物抗病信號分子，在植物識別病原體過程中不斷積累并可以觸發(fā)特定的下游信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)防御相關(guān)基因表達，產(chǎn)生防御蛋白以及具有抗菌活性的次生代謝物，進而增強植物抗病性[39]。ABA是植物應(yīng)對非生物脅迫的重要激素，可介導(dǎo)植物對多種非生物脅迫的適應(yīng)[39]。由此推測，VvWRKY70可能作為植物激素調(diào)控的下游基因，參與植物對生物和非生物脅迫的防御應(yīng)答過程。

VvWRKY70在進化上具有高度的保守性，可能在植物中發(fā)揮著基礎(chǔ)的生物學(xué)功能。其他物種中與VvWRKY70同源性較高的轉(zhuǎn)錄因子，被證實通過調(diào)控SA受體NPR1，激活依賴于NPR1的水楊酸下游信號通路，調(diào)節(jié)植物對病原真菌的抗性[2,11-12]，或者正調(diào)控應(yīng)激相關(guān)基因（如ADC、P5CS和NCED3等）的表達，增加植物對非生物脅迫的抵御能力[27,29]。SO2保鮮玫瑰香葡萄果實60 d后，果實組織中與激素信號、防御應(yīng)答和苯丙烷合成途徑相關(guān)的多個基因差異表達；次生代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮等含量增加，抗病酶幾丁質(zhì)酶（CHI）、β-1,3-葡聚糖甘酶（BGL）活性升高[23]，說明果實保鮮劑SO2處理誘導(dǎo)相關(guān)基因表達可提高果實的防御能力。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫抑制葡萄果實VvWRKY70的表達，而灰霉菌能誘導(dǎo)該基因高表達，暗示葡萄果實VvWRKY70可能參與了灰霉菌誘導(dǎo)的防御應(yīng)答過程。SO2保鮮過程中，同期低溫對照組該基因被顯著抑制，與低溫處理組結(jié)果一致，而SO2保鮮組VvWRKY70呈現(xiàn)高表達，說明SO2可能通過提高低溫環(huán)境下VvWRKY70的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，參與果實采后生理調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答反應(yīng)，但是關(guān)于其在葡萄逆境應(yīng)答及保鮮過程中的調(diào)控作用仍需進一步深入研究。

本研究通過生物信息學(xué)和表達特性分析，對功能未知的VvWRKY70基因有了初步的了解，預(yù)測該基因編碼322個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，屬于WRKY第Ⅲ亞家族，主要位于細胞核，可能受植物激素茉莉酸、水楊酸以及蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié)；VvWRKY70在葡萄多種組織細胞中表達，參與調(diào)節(jié)植株生理和果實發(fā)育過程；葡萄果實中VvWRKY70受灰霉菌和SO2誘導(dǎo)上調(diào)表達，參與葡萄采后生理過程的調(diào)節(jié)，但基因的具體功能和調(diào)節(jié)途徑有待進一步研究。