棉花GhWLIM5在棉纖維發育中的功能分析

張世鵬，劉文麗，程昌豪，李學寶，李揚

（華中師范大學 生命科學學院/遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079）

棉花為錦葵科棉屬植物，是世界范圍內重要的經濟作物之一，可為紡織工業提供天然原料。目前，全球種植最為廣泛的是四倍體的陸地棉（Gossypium hirsutum），其纖維產量占總棉花產量的90%，具有重要的經濟價值[1]。棉花纖維是棉花胚珠表皮細胞分化而來的單細胞毛狀突起，其發育過程是一個復雜而高度程序化的過程，可被分為4個相互重疊的時期：起始期、快速伸長期、次生壁生物合成期及脫水成熟期[2]。棉纖維細胞的發育起始于開花當天，大約持續至開花后5 d，只有20%～30%的胚珠表皮細胞可以分化形成最終的長纖維。起始期和伸長期之間并沒有顯著的時間節點，通常認為開花5 d后，棉纖維就已經進入了伸長期，并將持續至20 d。該時期是棉花纖維細胞的快速生長時期，決定著棉纖維的最終長度。在開花后16 d左右，棉纖維細胞開始大量合成纖維素，標志著棉纖維細胞發育進入了次生壁生物合成期，這個時期纖維素的合成與沉積量決定了成熟棉纖維的強度。這個過程通常持續到40 d，之后棉纖維發育進入到脫水成熟期[3]。

作為真核細胞細胞骨架重要組成成分之一，肌動蛋白細胞骨架廣泛參與細胞的形態維持、細胞器的運動、細胞分裂、細胞遷移、物質的囊泡運輸和細胞內信號轉導等[4-6]。棉纖維正常生長發育依賴于細胞中肌動蛋白細胞骨架的動態行為，早期體外藥學試驗顯示，肌動蛋白結合蛋白（F-Actin）在發育的纖維細胞中參與調控微管的定向[7]。而在纖維長絨極度縮短的ligon lintless突變體中，F-Actin 結構呈現不規則排列狀態[8]。此外，抑制棉纖維伸長期優勢表達的GhACT1基因的表達，會造成肌動蛋白細胞骨架變少，棉纖維伸長生長受到嚴重抑制[9]。

肌動蛋白細胞骨架的動態特征依賴于各種肌動蛋白結合蛋白的協同作用，它們通過結合、成核、封端、切割、解聚、成束、交聯等方式參與形成不同形態的肌動蛋白骨架[10]。在棉花中，下調肌動蛋白解聚因子GhADF1的表達能夠提高纖維中F-Actin的聚合度，同時提高棉纖維的長度和強度[11]。而過量表達GhPFN2能夠增加纖維細胞的微絲密度及成束度，進而促進纖維細胞中早期纖維素的沉積[12]。

LIM蛋白是一類古老而保守的蛋白家族，大多包含1個或多個LIM結構域（C-X2-C-X16-23-HX2-C）-X2-（C-X16-21C-X2-3-（C/D/H）），參與蛋白與蛋白的相互作用[13]。植物中的LIM蛋白被分為4組。其中，亞族又可分為3個類型：PLIM、WLIM及XLIM[14]。迄今為止，大部分植物LIM蛋白都被認定為肌動蛋白結合蛋白，能夠促進F-Actin的成束，調節肌動蛋白動態平衡，并保護F-Actin不發生解聚[15-18]。在棉花中，GhWLIM1a和GhXLIM6也均被報道參與棉纖維中F-Actin的成束反應[19-20]。先前研究表明，GhWLIM5蛋白在體外能夠結合F-Actin并促進F-Actin成束，但其在棉纖維中的功能及其與其他LIM蛋白是否存在功能差異仍不清楚[21]。

本研究對GhWLIM5蛋白參與棉纖維發育中FActin成束調控進行深入探討，并檢測pH對GhWLIM5蛋白功能的影響，同時也比較不同LIM蛋白結合和促進F-Actin成束能力的差異，為深入理解LIM蛋白在棉纖維發育中的功能提供重要的科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試棉花品種為陸地棉（Goasypium hirsutum）珂字 312；蛋白表達載體為pET-28a；植物轉化載體為pBI121；蛋白表達菌株為BL21；植物轉化農桿菌菌株為LBA4404。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建 為構建GhWLIM5RNAi載體，約250 bp的GhWLIM5的CDS片段首先以反向重復的方式被克隆進pBluescript SK載體，然后通過雙酶切定向連接方式克隆進pBI121載體（35S::GhWLIM5RNAi）或pBI101-TUA9載體（TUA9p::GhWLIM5RNAi），引物分別為GhWLIM5-L1、GhWLIM5-R1和GhWLIM5-L2、GhWLIM5-R2。為構建GhWLIM5和GhXLIM6原核表達載體，不含終止密碼子的GhWLIM5、GhXLIM6的編碼序列被克隆到pET-28a載體中，引物分別為Gh-WLIM5-EL、GhWLIM5-ER和GhXLIM6-EL、GhXLIM6-ER。

1.2.2 植物材料生長條件 棉花種子經濃硫酸脫絨后，28 ℃培養箱中浸泡1 d后，將露白種子于營養土中在23 ℃培養室中萌發育苗，16 h光照/8 h黑暗。待其生長至二葉期后，移植到大田繼續培養。

1.2.3 高速共沉淀與低速共沉淀 將GhWLIM5和GhXLIM6原核表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3），用以表達GhWLIM5和GhXLIM6蛋白。重組蛋白在天然條件下用Ni-NTA瓊脂糖進行親和純化后，用截流大小為10 ku的超濾管將buffer置換為Exchanged buffer（100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4）。

高速、低速共沉淀分析利用Cytoskeleton公司的Actin Binding Protein Biochem Kit進行。首先，將兔源肌動蛋白用General Actin buffer（5 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2，pH值8.0）溶解至濃度為10 μmol/L，隨后加入到Actin Polymerization buffer（5 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2、0.2 mmol/L ATP、1.0 mmol/L DTT、2 mmol/L MgCl2，pH值8.0）中使G-Actin聚合成F-Actin。然后將不同濃度蛋白加入到預組裝的F-Actin聚合體系中，于24 ℃條件下孵育30 min，于4 ℃進行離心1 h（高速共沉淀分析離心力為200 000 g，低速共沉淀分析離心力為14 000 g）。上清和沉淀分別收集，SDS PAGE電泳后用考馬斯亮藍G250進行染色分析。

1.2.4 棉纖維F-Actin染色觀察 棉纖維F-Actin染色參照WANG等[17]方法進行。將胚珠在含有0.66 μmol/L Atto 488 phalloidin、0.1 mol/L PIPES（pH值7.0）、0.05% Triton X-100、1 mmol/L MgCl2、3 mmol/L DTT、0.3 mol/L PMSF、5 mmol/L EGTA和0.25%戊二醛的PBS中室溫孵育10 min，漂洗干凈后，將纖維從胚珠上切下并固定在載玻片上，加入抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，在激光共聚焦顯微鏡（徠卡，SP5）下進行觀察。

1.2.5 胚珠體外培養 取開花前1 d棉桃，用75%酒精進行表面消毒1 min，然后用無菌水清洗干凈。切開棉桃，取出胚珠置于BT培養基（含0.5 μmol/L IAA和0.5 μmol/L GA）中，30 ℃靜置避光培養。

1.2.6 基因表達檢測 利用天根RNApre Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取各組織RNA，利用HiScript II 1st Strand cDNA synthesis Kit試劑盒將1 μg總RNA反轉錄成cDNA。以GhTUB作為內標進行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應條件及基因表達水平計算方法參照文獻[18]的方法進行。

1.3 數據分析

利用Image J軟件進行微絲定量分析，將微絲圖像骨骼化后統計圖片的Skewness值，代表微絲成束度。使用稱量臺對總種子數大于100粒的質量進行統計，利用量尺對棉纖維長度進行統計，數據以平均值±標準差呈現；統計分析采用SPSS 13及Excel軟件進行。

2 結果與分析

2.1 GhWLIM5 RNAi轉基因棉花表型分析

為了探討GhWLIM5在棉纖維發育中的功能，分別構建了35S啟動子和纖維伸長期優勢性啟動子TUA9p啟動的GhWLIM5RNAi載體，轉化棉花并均獲得了一些轉基因棉花。其中，35S::Gh-WLIM5RNAi共2個株系，TUA9p::GhWLIM5共4個株系。對這些轉基因棉花（T2）開花后9 d棉纖維中GhWLIM5的表達量進行檢測，結果顯示，在轉基因棉花纖維中，GhWLIM5的表達量均發生顯著下調（圖1-A）。

圖1 GhWLIM5 RNAi轉基因棉花纖維表型分析Fig.1 Phenotype analysis of fiber GhWLIM5 RNAi transgenic cotton

表型觀察發現，這些轉基因棉花成熟纖維長度較野生型更短，而其種子大小則沒有顯著差異（圖1-B、1-D）。每個株系隨機選取50顆種子測量棉纖維長度，結果表明，除TUA9p::GhWLIM5RNAi株系3（TUA3）及35S::GhWLIM5RNAi株系1（35S1）外，其他轉基因株系成熟棉纖維長度均較WT顯著變短。測量和統計結果顯示，轉基因棉纖維長度較野生型相比均減少5%～15%，二者存在顯著或極顯著差異（圖1-C）。

隨后，選取了棉纖維品質4個常用性狀（纖維長度、馬克隆值、纖維強度及伸長率）對野生型及GhWLIM5RNAi轉基因棉花成熟纖維進行了品質分析。由表1可知，轉基因棉花纖維上半部分長度均短于野生型，這與手動測量分析結果基本吻合。同時，GhWLIM5RNAi轉基因棉花（除TUA3外）纖維的強度值也比野生型降低了4.0%～8.9%（表1）。此外，馬克隆值作為棉花的重要品質指標，能夠有效地反映棉花纖維細度與成熟度[22-25]，也間接反映了棉纖維細胞壁厚度。品質分析結果顯示，野生型棉纖維馬克隆值為5.44，而大多GhWLIM5RNAi轉基因植株的棉纖維馬克隆值則比野生型降低了2.0%～32.4%。這些結果暗示，GhWLIM5可能不僅參與棉纖維伸長生長，還影響棉纖維次生壁發育。

表1 野生型與GhWLIM5表達抑制棉花纖維品質分析Tab.1 Cotton fiber quality analysis of wild type and GhWLIM5 expression inhibited

為進一步檢測纖維生長速度，本研究在體外進行胚珠培養，在快速伸長期測量纖維長度，結果如圖2-A所示，在相同的培養環境下，野生型棉纖維細胞生長速度快于GhWLIM5RNAi轉基因棉纖維細胞。培養12 d后野生型棉纖維細胞長度約為12.5 mm，而轉基因植株（除TUA3外）棉纖維細胞長度在8.0～10.5 mm（圖2-B）。在培養15、18 d后，轉基因植株的棉纖維長度依然短于野生型（圖2-C、D）。以上結果說明，抑制GhWLIM5的表達能夠抑制棉纖維伸長生長，意味著GhWLIM5在棉纖維伸長生長過程中起著重要作用。

圖2 GhWLIM5 RNAi轉基因棉花胚珠離體培養纖維生長情況分析Fig.2 Fiber growth analysis of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton ovules cultured in vitro

2.2 棉纖維F-Actin聚合度檢測

先前研究表明，GhWLIM5蛋白在體外能夠促進F-Actin絲束的聚合[21]。因此，本研究用Atto 488-鬼筆環肽對處于開花后12 d的野生型及GhWLIM5RNAi轉基因植株棉纖維進行染色，分析GhWLIM5對棉纖維中F-Actin細胞骨架的影響。結果表明（圖3），野生型棉纖維中，肌動蛋白絲束與棉纖維細胞生長方向平行，F-Actin絲束聚合度較高（圖3-A）；而無論是在35S::GhWLIM5RNAi還是在TUA9p::GhWLIM5RNAi轉基因棉花中，F-Actin絲束的聚合程度都發生了下降（圖3-B、C）。用Image J對F-Actin的Skewness值進行計算用以量化F-Actin的聚合度，結果顯示，GhWLIM5抑制程度較高的轉基因株系（35S2、TUA1、TUA2）棉纖維F-Actin的Skewness值顯著低于野生型，且FActin聚合程度和GhWLIM5的表達量呈正相關（圖3-D）。以上結果表明，GhWLIM5通過增加F-Actin的成束度調控棉纖維細胞內微絲骨架高級結構重排，進而促進棉纖維的伸長生長。

圖3 GhWLIM5 RNAi轉基因棉花纖維中的肌動蛋白細胞骨架Fig.3 Actin cytoskeleton in fibers of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton

2.3 pH對LIM蛋白促進F-Actin成束能力的影響

有研究表明，LIM蛋白促進F-Actin成束的能力受到pH的影響[26]。為檢測GhWLIM5的功能是否也受到pH的調節，本研究表達并純化了GhWLIM5蛋白，并在體外進行了F-Actin聚合反應，利用低速共沉淀檢測在不同pH環境下GhWLIM5促進FActin成束的能力。結果顯示，在加入了相同量的GhWLIM5蛋白后，pH條件不一樣F-Actin的聚合程度不同（圖4-A）。測量與統計結果表明，當反應體系中無GhWLIM5時，不論在哪種pH條件下，均有約40%的F-Actin存在于沉淀中，說明pH不影響F-Actin的自身聚合能力。但在加入GhWLIM5后，在pH值為6.2時，處于沉淀中的F-Actin比例提高到約70%；當pH值升到7.0時，處于沉淀中的FActin比例降至50%左右；而當pH值升到7.4后，處于沉淀中的F-Actin比例降至和不加GhWLIM5時一樣，均為40%左右（圖4-B）。由此可見，GhWLIM5促進F-Actin成束的能力與pH環境密切相關，隨著pH值的升高，GhWLIM5促進F-Actin成束的能力逐漸下降。

圖4 低速共沉淀分析不同pH條件下GhWLIM5促進F-Actin成束能力Fig.4 Ability of GhWLIM5 promoting F-Actin bundles under different pH conditions by low-speed co-sedimentation

2.4 不同LIM蛋白結合F-Actin能力的比較

先前研究表明，不同LIM蛋白結合F-Actin的能力存在差異[15]。為比較GhWLIM5和XLIM家族的GhXLIM6對F-Actin的結合能力差異，將過量GhWLIM5和GhXLIM6蛋白分別與等量F-Actin孵育后進行高速共沉淀試驗，檢測二者與F-Actin的結合能力。結果顯示，加入同等濃度F-Actin的情況下，經高速離心（200 000 g），GhXLIM6存在于沉淀中的比例明顯高于GhWLIM5，說明GhWLIM5結合F-Actin的能力弱于GhXLIM6（圖5-A）。

圖5 不同LIM蛋白結合與促進F-Actin成束的能力比較Fig.5 Comparison of ability of different LIM proteins to bind and promote F-Actin bundles

進而，將不同濃度GhWLIM5和GhXLIM6蛋白與一定量的F-Actin進行體外聚合反應后，通過低速共沉淀檢測它們促進F-Actin成束的能力。結果顯示，添加到4 μmol/L的GhWLIM5可使70%的低聚合度的F-Actin聚合成高聚合度的F-Actin絲束，而達到同樣的效果，GhXLIM6只需要添加到2 μmol/L，說明GhWLIM5促進F-Actin成束的能力不如GhXLIM6（圖5-B）。

2.5 棉纖維中纖維素合酶表達水平比較

纖維品質分析結果顯示，GhWLIM5RNAi轉基因棉花成熟纖維斷裂比強度低于野生型，說明抑制該基因的表達還會影響棉纖維次生壁的發育。成熟棉纖維中超過90%為纖維素，為進一步探索該基因是否能和XLIM一樣調控棉纖維中纖維素合酶——GhCESA4/7/8的表達，進行了實時熒光定量PCR試驗，結果表明，和野生型相比，在轉基因棉花纖維中這些纖維素合酶基因的表達并未發生明顯變化（圖6），說明GhWLIM5可能不直接影響棉纖維次生壁發育。

圖6 次生壁相關纖維素合酶基因在GhWLIM5 RNAi轉基因棉花纖維中的表達情況Fig.6 Expression of secondary wall related cellulose synthase genes in GhWLIM5 RNAi transgenic cotton fibers

3 結論與討論

作為細胞內長距離運輸的軌道，肌動蛋白細胞骨架在尖端或者極性生長的細胞中，如花粉管、根毛、棉纖維等，發揮著至關重要的作用[19-20,27-29]。先前研究表明，GhWLIM5在伸長期的纖維中優勢表達，而這個時期是纖維細胞生長速度到達頂峰的階段[21]。為了滿足細胞快速生長的需求，該時期的纖維細胞需要高效的囊泡及細胞器的運輸，也意味著需要更為高效的微絲重排。當具有促進F-Actin成束功能的GhWLIM5蛋白在棉纖維細胞中含量不足時，將直接降低細胞中微絲的成束能力，導致纖維細胞中囊泡及細胞器運輸能力下降，抑制棉纖維生長。事實上，目前的研究也證實，在GhWLIM5RNAi轉基因棉花中，GhWLIM5表達量越低，纖維細胞中微絲成束程度就越低，最終棉纖維長度越短。

先前研究表明，擬南芥和百合中的PLIM蛋白促進F-Actin成束的能力受到pH的影響，低pH環境更利于PLIM對F-Actin成束的促進作用；而擬南芥中WLIMs的活性與pH無關[15,17]。研究顯示，在棉花中WLIM蛋白GhWLIM5促進F-Actin成束的能力受到pH的調節，這與擬南芥、百合中的PLIM的特性較為相似。而GhXLIM6則表現出與擬南芥中WLIM蛋白相似特性，對pH相對不敏感[26]。由此可見，在棉花纖維發育過程中，LIM蛋白的功能受到更為復雜地調控，同時兼有花粉管和根毛中存在的調控方式，這與棉花纖維生長呈現獨特、向頂的擴散性生長模式是相一致的[30]。

此外，雖然抑制GhWLIM5也會引起棉纖維次生壁的發育受阻，但和GhXLIM6不同的是，GhWLIM5并不表現出直接調控次生壁基因的表達。這意味著棉花中不同LIM蛋白在棉纖維發育過程中出現一定的功能分化，WLIM類傾向于行使F-Actin成束蛋白的功能，而XLIM類則兼任FActin成束蛋白及轉錄因子2個角色。先前有研究表明，F-Actin和微管細胞骨架組織的活性變化不僅關系到纖維的伸長生長，還能夠影響到棉纖維次生壁的合成。尤其是纖維細胞中較早形成的肌動蛋白束，能夠促進微管重排及纖維素沉積[12]。而GhWLIM5在纖維發育起始及伸長期均有較高的表達量，意味著該蛋白在這2個時期對肌動蛋白絲束的聚合都有著重要的促進作用。在GhWLIM5RNAi轉基因棉花纖維中，GhWLIM5的缺失直接導致在纖維生長的早期即發生了F-Actin聚合程度的下降，這可能造成纖維細胞中微管重排的紊亂和纖維素沉積的異常，這或許是GhWLIM5RNAi轉基因棉花纖維細胞壁發育受影響的原因。