芋可溶性淀粉合成酶CeSS基因家族的克隆和表達分析

王 立, 殷劍美, 韓曉勇, 蔣 璐, 郭文琦, 金 林, 張培通

(江蘇省農業科學院經濟作物研究所,江蘇 南京 210014)

淀粉是儲存在葉片葉綠體或儲存器官中的主要化合物,被用作種子休眠和植物生長的能量來源,也是人類和動物最重要的能量來源,并被廣泛用作工業生產的原料。植物主要合成支鏈淀粉和直鏈淀粉,兩者的結構和比例決定了淀粉的理化特性,如溶脹、溶解性、可塑性和黏度等[1-2]。

研究結果顯示,可溶性淀粉合成酶(SSS)通過催化形成α-1,4糖苷鍵延長合成具有不同長度的支鏈淀粉,決定支鏈淀粉的鏈條長度和鏈長分布,從而影響支鏈淀粉的理化性質以及淀粉粒的結構和品質[2-3]。SSS主要存在于植物葉片和貯藏組織,主要分為4個亞家族,即SSI、SSII、SSIII和SSIV,大多存在于質體基質中。SSI主要參與支鏈淀粉的短鏈產生,SSII和SSIII參與支鏈淀粉的鏈條延伸[3]。研究結果顯示,SSI在馬鈴薯塊莖淀粉合成中的酶活性較弱,而在水稻和玉米胚乳中具有較強的活性;下調SSII的轉錄水平會影響馬鈴薯塊莖中的鏈長分布,改變淀粉結構和其他淀粉合成酶活性[2,4-5]。此外,SSS每個亞家族又含有同工酶,但是這些同工酶如何影響植物中合成的支鏈淀粉的數量和組成尚待闡明。目前關于芋可溶性淀粉生物合成的研究相對較少,對于淀粉合成酶的功能尚不清楚。

本研究在靖江香沙芋轉錄組測序基礎上,克隆獲得3個芋可溶性淀粉合成酶CeSS家族基因,通過分析氨基酸序列、蛋白質結構和親緣進化關系,檢測3個基因的轉錄表達譜,探索其與淀粉豐度形成的關系,從而加快芋可溶性淀粉合成機理的深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為靖江香沙芋, 種植于江蘇省農業科學院六合試驗基地。分別在種植60 d、90 d、120 d、150 d和180 d取樣。地上部組織取樣部位為葉片和葉柄,地下部組織取樣部位為母芋、子芋和根。葉片打孔取樣,葉柄切段取樣,球莖去皮取樣,根洗去雜質取樣,統一貯存于-80 ℃冰箱。每個組織取樣質量約1.5 g,設3份重復。

1.2 cDNA合成

采用 RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司產品]提取樣品RNA,cDNA合成采用寶生物工程(大連)有限公司PrimeScript RT reagent Kit和RNA PCR Kit,試驗方法參照試劑盒說明書。

1.3 基因克隆

根據已獲得的靖江香沙芋轉錄組數據,通過BLASTx方法比對獲得CeSS基因信息,使用Primer Premier 5.0設計基因克隆引物和基因表達引物(表1)。PCR擴增方法參考王立等[6]的方法。PCR擴增產物送北京鼎國科技公司完成序列測定。

表1 CeSS家族基因特異引物

1.4 氨基酸序列和進化分析

采用DNAman完成氨基酸序列同源性比較,在MEGA v4.0中構建系統進化樹。采用SMART在線數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質結構域預測,在ExPaSy網站(http://web.expasy.org/compute_pi/)計算等電點和相對分子質量,采用Cell-PLoc 2.0 package預測亞細胞定位。

1.5 轉錄表達分析

以Actin基因為內參基因。采用SYBR PremixExTaqKit進行qRT-PCR檢測,按照試劑盒說明書操作。定量RT-PCR反應體系為20 μl,程序如下:95 ℃ 30 s;每循環95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,40個循環;最后95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,每個樣品3次重復。參考Livak等[7]的方法計算基因相對表達量。

1.6 支鏈淀粉含量測定

采用何潔等[8]雙波長法測定芋球莖中的支鏈淀粉含量。取播種后不同時期球莖干燥樣品,質量為0.1 g,用1 ml無水乙醇+9 ml 1 mol/L KOH研磨,沸水浴加熱溶解10 min,冷卻后定容至100 ml。檢測535 nm、757 nm下的吸光值,計算支鏈淀粉含量。

1.7 數據處理

使用 Microsoft Excel 2010 軟件和 SPSS 17.0 軟件進行試驗數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 芋可溶性淀粉合成酶家族基因克隆及序列分析

經過BLAST比對,共鑒定獲得3個芋可溶性淀粉合成酶SS基因,分別命名為CeSSI、CeSSII、CeSSIII。CeSSI基因堿基序列全長為1 932 bp,編碼643個氨基酸(圖1),蛋白質相對分子質量和理論等電點分別為70 795和6.02(表2)。CeSSII基因堿基序列全長為2 409 bp,編碼802個氨基酸(圖2),蛋白質相對分子質量和理論等電點分別為88 702和5.75(表2)。CeSSIII基因堿基序列全長為3 606 bp,編碼1 202個氨基酸(圖3),蛋白質相對分子質量和理論等電點分別為136 248和5.47(表2)。蛋白質親水性預測和亞細胞定位預測結果(表2)顯示,3個CeSS蛋白均為親水性蛋白質,且均定位在葉綠體。

圖2 CeSSII氨基酸序列分析Fig.2 Amino acid sequence analysis of CeSSII

圖3 CeSSIII氨基酸序列分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of CeSSIII

表2 CeSS基因家族及其編碼蛋白質的生化特性

2.2 芋可溶性淀粉合成酶氨基酸序列和進化分析

圖4顯示,3個SS蛋白的氨基酸序列比較相似,均含有Glyco_transf結構域,其中CeSSI和CeSSII蛋白含有1個Glyco_transf_5結構域(CeSSI,Asn135～Ser393;CeSSII,Asn312～Glu555)和1個Glyco_trans_1_4結構域(CeSSI,Asp448～Ile597;CeSSII,Leu608～Thr762),而CeSSIII僅含有1個Glyco_trans_4結構域(Gly770～Gly944),以及3個CBM_25結構域(Gly316～Glu402、Glu492～Pro583、Gly654～Thr745)。

圖4 CeSS蛋白Pfam結構分析Fig.4 Pfam structure of CeSS protein

系統進化分析結果(圖5)表明,3個SS蛋白聚類分為3組,表現出進化差異:CeSSI與海棗(Phoenixdactylifera, XP_008783178.1)中SS蛋白最接近,序列相似度為62.9%,其次是菜豆(Phaseolusvulgaris,BAD18845.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana, NP_197818.1),序列相似度分別為59.7%和59.4%;CeSSII與蘆筍(Asparagusofficinalis,XP_020257302.1)中相應蛋白質較相近,序列相似度為56.3%,其次是菠蘿(Ananascomosus,XP_020104470.1)和繁穗莧(Amaranthuscruentus,ABA64552.1);CeSSIII與藥用稻(Oryzaofficinalis,AIU99454.1)SS蛋白相似度最高,序列相似度為55.5%,其次是玉米(Zeamays, AFW59498.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_172637.2)。

Amaranthus cruentus:繁穗莧;Ananas comosus:菠蘿;Arabidopsis lyrata subsp. lyrata:擬南芥琴亞科;Arabidopsis thaliana:擬南芥;Asparagus officinalis:蘆筍;Brassica napus:甘藍型油菜;Capsella rubella:芥菜;Colocasia esculenta:芋;Elaeis guineensis:油棕;Glycine max:大豆;Ipomoea batatas:甘薯;Malus domestica:蘋果;Manihot esculenta:木薯;Morus notabilis:川桑;Nelumbo nucifera:蓮;Oryza officinalis:藥用稻;Oryza sativa Japonica group:粳稻;Phaseolus vulgaris:菜豆;Phoenix dactylifera:海棗;Populus euphratica:胡楊;Prunus mume:梅花;Ricinus communis:蓖麻;Solanum lycopersicum:番茄;Theobroma cacao:可可;Triticum aestivum:小麥;Vitis vinifera:葡萄;Zea mays:玉米。圖5 不同植物SS家族基因系統進化分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of SS family genes in different plant species

2.3 芋可溶性淀粉合成酶家族基因的表達水平分析

圖6顯示,芋可溶性淀粉合成酶家族的3個基因CeSSI、CeSSII、CeSSIII在芋的不同組織中均有表達,但在母芋和子芋中高表達,在根、葉片和葉柄中低表達,說明同一基因的組織表達譜差異較大;而在同一組織中,尤其是母芋和子芋中,CeSSII基因表達量最高,其次是CeSSI和CeSSIII。圖7顯示,在芋發育過程中,葉片中CeSSI、CeSSII、CeSSIII基因表達趨勢基本不變,而球莖中的表達水平均高于葉片。球莖中的CeSSI、CeSSII基因在種植60 d后表達量開始提高,在種植150 d表達水平達到峰值,隨后略有下降;而CeSSIII基因在種植60 d后在球莖中表達量開始上調,在種植120 d時表達增速最快,隨后表達水平趨緩,在種植180 d時表達水平最高。

同一基因不同組織間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 CeSSI、CeSSII和CeSSIII在不同芋組織中的表達Fig.6 Expression of CeSSI, CeSSII and CeSSIII in different tissues of taro

同一組織間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 CeSSI (A)、CeSSII (B) 和 CeSSIII (C)在芋不同發育時期的表達Fig.7 Expression of CeSSI (A), CeSSII (B) and CeSSIII (C) at different developmental stages of taro

2.4 CeSSIII的基因表達與芋球莖支鏈淀粉含量相關性分析

圖8顯示,芋球莖支鏈淀粉含量呈持續增長趨勢,在種植120～150 d增長速率最高,球莖支鏈淀粉含量在種植180 d達到較大值。相關性分析結果顯示,芋球莖CeSSIII的表達水平與支鏈淀粉含量之間存在明顯正相關性。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 不同發育時期芋球莖中支鏈淀粉含量分析Fig.8 Amylopectin contents in corms of taro at different development stages

3 討 論

3.1 芋可溶性淀粉合成酶家族成員具有各自獨特功能

在植物葉片和貯藏組織中已經發現了4種形式的淀粉合成酶:SSI、SSII、SSIII和SSIV[1,9]。在馬鈴薯上的研究結果顯示,SSI和SSII是主要淀粉合酶,會影響淀粉含量和結構,SSIII是支鏈淀粉主要合成酶,其活性占塊莖可溶性淀粉合成酶活性的80%[3]。本研究結果顯示,靖江香沙芋中存在3個可溶性淀粉合成酶,均具有類似的Glyco_transf結構域,它們與腺苷二磷酸(ADP)葡萄糖結合,催化合成淀粉,而CeSSIII中除了同樣的Glyco_transf結構域以外,還包含3個CBM_25結構域,具有淀粉結合特性,可能與淀粉鏈長有關[2]。前人研究發現,SSI氨基末端區域高度保守的KXGGL基序,是可溶性淀粉合成的起始酶,與糖原合成酶底物ADP-葡萄糖結合,可能對芋的短支鏈淀粉合成具有重要作用[10]。SSII可影響支鏈淀粉的分支合成,改變淀粉粒的晶體層結構和淀粉糊化溫度[1]。SSIII中含有的六肽基序(RYGTVPVV)與14-3-3蛋白結合位點基序相關[1, 11],后者通過負調控擬南芥中可溶性淀粉合成酶活性,進而影響擬南芥葉片中淀粉積累,說明CeSSIII與芋淀粉儲藏密切相關[2]。

3.2 3個芋可溶性淀粉合成酶基因與淀粉合成緊密相關

本研究結果表明,CeSSI、CeSSII和CeSSIII主要在芋球莖中表達,但在芋的不同發育階段,3個基因表現出不同的表達模式。CeSSI和CeSSII在未成熟的芋球莖中表達水平較高,與馬鈴薯中的轉錄表達趨勢相似,即在種植90 d左右明顯上調表達,表明CeSSI和CeSSII更趨向于參與芋球莖中瞬時淀粉的合成[2, 5];而CeSSIII的轉錄上調時間相對較遲,在種植120 d時上調速率最高,在種植180 d的成熟球莖中表達水平最高,與在香蕉中的表達模式基本一致,說明CeSSIII更傾向于參與貯藏淀粉的合成[12]。

本研究發現,在芋發育過程中,芋球莖中支鏈淀粉含量持續增加,在種植180 d達到較大值,而且芋球莖中CeSSIII基因表達量與芋球莖中支鏈淀粉含量呈正相關,表明CeSSIII與芋球莖中淀粉貯藏有關。該結果與在馬鈴薯上的研究結果類似,馬鈴薯塊莖中SSIII活性占總SS活性的80%,與貯藏淀粉的合成密切相關[3]。

本研究結果表明,芋可溶性淀粉合成酶基因家族的3個基因與球莖淀粉合成密切相關,其中CeSSI和CeSSII參與芋球莖中瞬時淀粉的合成,而CeSSIII更傾向于參與貯藏淀粉的合成。今后需要對芋可溶性淀粉合成酶基因進行深入研究,以明確和驗證CeSSI、CeSSII和CeSSIII基因功能。