不同酶組合致兔眼玻璃體液化的實驗研究

陳萍萍，駱陽，徐博懷，楊路

玻璃體是眼睛屈光介質的一個組成部分，水占玻璃體的98%，大分子物質占玻璃體的0.15%，包括透明質酸、膠原纖維和可溶性的蛋白質[1]。主要結構成分是細纖維網狀支架中的II型膠原纖維和交織于支架間的透明質酸粘多糖，其中Ⅱ型膠原纖維是玻璃體中的主要膠原成分，占膠原纖維總量的70%～80%[2]。膠原纖維的支架結構隨著年齡增長而收縮和塌陷，進一步導致玻璃體液化和玻璃體后脫離（PVD）。玻璃體的液化與許多眼病有關，如黃斑裂孔、視網膜脫離及玻璃體積血等[1]。因此，構建玻璃體液化模型，進一步研究玻璃體液化機理，尋求更好的預防和治療方法具有重要意義。目前已發現有多種酶可誘發玻璃體液化，如軟骨素酶（CA）、基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、透明質酸酶（HA）、纖溶酶（PL）、膠原酶、中性蛋白酶及納豆激酶等[3]。本研究應用20 IU HA 聯合1 IU PL 及0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 兩種組合酶進行兔眼玻璃體腔內注射，對兔眼進行臨床檢查及HE 染色，旨在觀察及比較兩種組合酶誘導玻璃體液化及PVD的快速性、有效性和安全性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物準備 健康成年新西蘭白兔24 只（由寧波大學醫學部實驗動物中心提供），雌雄不拘，月齡為4～5 個月，體質量為2.5 ～3.0 kg。將24 只白兔采用完全隨機分組法分成3 組，A 組11 只，B 組11 只，C組2 只作為空白組，A 及B 組均以右眼為實驗眼，左眼為對照眼。實驗前復方托吡卡胺眼藥水散瞳，做常規眼科檢查，包括肉眼、裂隙燈顯微鏡（＋90 D 前置鏡）、間接檢眼鏡及眼部B超檢查等，以排除兔眼疾患。本研究經寧波大學實驗動物倫理委員會審批通過。1.2 實驗試劑 HA（北京索萊寶產品）、PL（美國Sigma 產品）、CA（美國Sigma 產品）、MMP-3（美國Sigma 產品），在注射前均用平衡鹽溶液（BSS 液）稀釋，濃度分別為20 IU/0.05 ml、1 IU/0.05 ml、0.2 U/0.05 ml 和10 ng/0.05 ml。

1.3 方法 玻璃體腔注射：注射前1 d 兩組兔眼均用加替沙星眼膏涂眼2 次，全身麻醉后兩組實驗眼于視乳頭前玻璃體后1/3 部位分別注射20 IU HA聯合1IU PL 及0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3，兩組對照眼相同部位注射BSS 0.1 ml，C 組不做任何處理。術后加替沙星眼藥膏涂眼，繼續2 次/d，用3 d。所有操作均為同一組人員完成。

1.4 觀察指標 在注射后1 h 進行第一次觀察，之后每天觀察1 次直至其被處死。在每次觀察之前，用復方托吡卡胺滴眼液散瞳，丙美卡因眼藥水眼表麻醉，而后將兔子固定于兔子固定器內，用開瞼器撐開上下眼瞼進行眼部檢查。觀察項目：肉眼、裂隙燈顯微鏡、＋90 D 前置鏡及間接檢眼鏡檢查，主要檢查是否有炎癥反應，晶狀體、玻璃體和視網膜的變化。如果在第一次檢查中發現手術引起的眼部損傷，則該兔眼不納入實驗。檢查后滴用乳酸左氧氟沙星滴眼液。每天進行眼部B 超檢查，檢查后用加替沙星眼藥膏涂眼。注射后3、7、14 d 采用簡單隨機抽樣法分別從A組及B組中各隨機選擇2 只兔子（4 只眼），并于第14 天從空白組中隨機抽取兔一只（2 只眼）。眼球摘除后，從3 組中隨機抽取的兔子里再任取1 只兔子（2 只眼）進行冰凍切片后HE 染色，用光學顯微鏡檢查。另一只兔子（2 只眼）放在—80 ℃冰箱內存儲。1.5 統計方法 采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用Fisher精確概率法，P＜0.05表示差異有統計學意義。當進行兩組之間比較時，值采用Bonferroni調整后的水平進行判斷，調整水平為0.017，為原水平（0.05）與分組數量（3）的比值，兩兩比較時P ＜0.017 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床觀察 A 組及B 組的前房炎癥反應、玻璃體混濁、玻璃體液化、部分性PVD 及完全性PVD 見表1 ～2，裂隙燈（＋90 D 前置鏡）檢查兔眼玻璃體可見濃縮玻璃體后皮質，眼部B超檢查兔眼玻璃體，可見玻璃體完全后脫離，見圖1。

圖1 裂隙燈顯微鏡聯合眼部B 超觀察兔眼結果

表1 A 組實驗眼臨床觀察結果只眼

表2 B 組實驗眼臨床觀察結果只眼

2.2 HE 染色結果 實驗組和對照組兔眼術后視網膜形態和細胞結構在光學顯微鏡觀察下與正常組相比無明顯異常，視網膜的神經節細胞、雙極細胞、光感受器細胞及視網膜色素上皮細胞均無水腫、破裂和壞死，結構清晰完整，排列整齊，視網膜厚度無明顯改變，見圖2。

圖2 視網膜冰凍切片光學顯微鏡檢查結果（HE 染色，×400）

2.3 注射后不同時間PVD形成的眼數 注射后第3天，3 組PVD 差異無統計學意義（P ＞0.05），在注射后第7 天，3 組PVD 差異有統計學意義（P ＜0.05）。A和B組實驗眼PVD差異無統計學意義（P＞0.017），兩組藥物引起完全性PVD 及部分性PVD 差異有統計學意義（P ＜0.017）；A、B 組實驗眼與對照組PVD差異均有統計學意義（均P ＜0.017）。注藥后第14天，3 組PVD 差異有統計學意義（P ＜0.05）；A 組實驗眼與B 組實驗眼PVD 差異無統計學意義（P ＞0.017），兩組藥物引起完全性PVD及部分性PVD差異無統計學意義（P ＞0.017）；A、B 組實驗眼與對照組PVD 差異均有統計學意義（均P ＜0.017）。A 組藥物注射后3、7、14 d 形成PVD 差異有統計學意義（P ＜0.05）；B 組藥物注射后3、7、14 d 形成PVD 差異有統計學意義（P ＜0.05），且在3 d 與7 d 以及3 d與14 d 形成PVD 差異均有統計學意義（均P ＜0.017）。B 組3 d 與7 d 藥物誘導完全性PVD 及部分性PVD 差異有統計學意義（P ＜0.017），見表3。

表3 注射后不同時間實驗組和對照組兔眼PVD 的形成情況只眼

3 討論

藥物的眼內注射部位對PVD的形成非常重要。由于玻璃體膠原纖維和透明質酸在玻璃體后皮質具有高密度，并且玻璃體后皮質緊密地黏附于黃斑、視乳頭及血管周圍[4]。因此，本研究將藥物注射到兔眼玻璃體中后1/3 處，很好的誘導出兔眼PVD。

本實驗研究發現兩組聯合酶均能有效誘導玻璃體液化及PVD，HA 可以快速有效地降解存在于玻璃體膠原纖維之間的透明質酸聚合物，導致玻璃體凝縮并促使玻璃體支架塌陷，這有利于PL快速擴散到玻璃體視網膜交界處[5-6]。PL 能夠降解在玻璃體視網膜交界面的層粘連蛋白、纖連蛋白及其他分子膠。PL 能激活基質金屬蛋白酶, 促使視網膜內界膜Ⅳ型膠原降解，從而誘導完全性PVD[7]。雖然PL不能直接降解玻璃體視網膜交界面的IV型膠原，但它可以間接將IV 型膠原纖維暴露，使其被其他酶消化[8-9]，還通過激活膠原酶，釋放彈性蛋白酶，產生纖維連接蛋白降解產物，起到消化IV 型膠原纖維的作用[10-11]。MMP-3 能在玻璃體視網膜交界面特異性水解細胞外基質，如纖連蛋白及層粘連蛋白等[12]。CA 能特異性水解硫酸軟骨素蛋白多糖，從而破壞玻璃體凝膠穩態，同時還可降低玻璃體視網膜界面的分子粘連[13]。

雖然兩組聯合酶在形成PVD 方面總體結果大致相同，但在注射后7 d形成完全性PVD和部分PVD時，0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 的效果明顯好于20 IU HA 聯合1 IU PL。而且，筆者在進一步比較每組聯合酶的術后3、7、14 d 形成PVD 時，發現A 組在注射后7d 時，仍未全部形成PVD；在注射后14d 時，仍有2 只兔眼未形成完全性PVD。而B 組在注射后7d已全部形成PVD；在注射后14 d 全部形成完全性PVD。這說明0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 組誘導形成玻璃體液化及PVD 的快速性優于20 IU HA 聯合1 IU PL 組。0.2U CA 聯合10 ng MMP-3 組也有不足之處，如藥物引起眼前房炎癥反應較重，不過在注射5 d 后均恢復正常且未見明顯視網膜異常。

綜上所述，本實驗證實了0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 及20 IU HA 聯合1 IU PL 應用玻璃體內注射均可以誘導玻璃體液化和完全性PVD的發生，并且對眼組織無明顯毒性作用，兩組聯合酶誘導形成玻璃體液化及PVD總體結果基本一致，這說明這兩組聯合酶均是藥物誘導PVD 的一種較為理想的試劑。但是0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 誘導玻璃體液化及PVD更具快速性且在第7 天誘導效果更佳。因此，0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 所致兔眼玻璃體液化效果更為快速、安全及有效。若使用其中一種聯合酶建立玻璃體液化模型進行研究，需綜合考慮其研究目的，快速形成PVD且不需要前期采取房水研究，建議選用0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3；需要采取房水做進一步研究且無時間限制，考慮到0.2 U CA 聯合10 ng MMP-3 注射引起前期的前房炎癥反應較重，可能會影響房水測定，建議選用20 IU HA聯合1 IU PL。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 陳萍萍：實驗操作、論文撰寫；駱陽、徐博懷：數據整理、統計學分析；楊路：研究指導、論文修改、經費支持