牛羊O型口蹄疫ELISA試驗的抗體檢測

高 波

（瓦房店市動物疫病預防控制中心，遼寧 瓦房店 116300）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引發的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。口蹄疫是人畜共患傳染病，被國際獸醫組織確定為一類傳染病，主要侵害偶蹄獸，它的臨診特征為體溫升高、精神不振、流涎，在唇部內面、齒齦、舌面、蹄部、乳房處皮膚出現水皰，水皰逐漸破裂后，體溫達到正常。口腔內出現水皰期間，趾間、蹄冠的較軟皮膚也出現水皰，破裂的水皰短時間形成爛斑，隨后逐漸康復，若護理不當，激發感染化膿菌，形成潰瘍壞死，甚至會出現蹄甲脫落。有的病牛在康復過程中，病情由好轉變為加重，全身衰竭，心臟停搏而死亡。此病傳染性極強。感染后傳播速度快，對人畜危害嚴重，因此，做好此疫病的預防、控制、消滅措施顯得格外重要。

口蹄疫病預防主要是通過疫苗的免疫使牛羊體內產生抗體，來保護牛羊不再發病，免疫質量好壞決定抗體的保護程度。通常采用酶聯免疫液相阻斷法檢測牛、羊血清中的口蹄疫O型抗體。檢測出抗體的OD值，通過OD值來判斷牛羊抗體的保護率。如果抗體的OD值下降，已經不在保護范圍內，就應該立即進行牛羊的疫苗免疫接種。不及時免疫，有可能造成牛羊發病，直接造成養殖戶的經濟損失。

現接到檢測任務，需要將20份牛血清做O型口蹄疫抗體檢測，介紹如下。

1 檢驗原理

采用酶聯免疫液相阻斷法。牛羊待檢樣品中O型抗體的含量與顯色OD值呈負相關，通過與病毒抗原對比來判斷抗體效價。試劑盒在22℃的實驗室回溫1小時。利用回溫時間準備試驗用的器材。100微升單道移液器、12道移液器、槍尖、量杯、量筒、加樣槽、拍板用的吸水紙等。

2 試劑配制

2.1 洗滌液配制

今天檢測牛血清樣品20份，洗板時所需要的洗滌液的體積為300微升×100孔×5次×2=300毫升。使用前拿出一包固體洗液加500毫升純化水，搖晃直至溶解，在無菌條件下配制試驗用洗滌液，可以在2～8℃條件下保存7天。配制的洗滌液用于洗板和抗原的稀釋。

2.2 樣品稀釋液（1x）配制

20份樣品所需的樣品稀釋液（1x）的體積為12毫升。使用前，將濃縮樣品稀釋液（5x）1份加4份蒸餾水稀釋，即3毫升濃縮樣品稀釋液（5x）加入12毫升純化水。在無菌條件下配制（無菌水和無菌容器）樣品稀釋液（1x）共計15毫升。在2～8℃條件下能夠保存1個月。配制好的樣品稀釋液（1x）用來作樣品的稀釋，也用作陰陽對照的稀釋。

3 具體操作步驟

試驗前，將所有的試劑盒組份取出來，放在實驗臺上，應恢復到20～26℃1小時。試劑使用時，輕輕搖晃均勻后倒入加樣槽內。

稀釋濃縮病毒抗原：使用配制好的洗滌液，按450倍稀釋濃縮病毒抗原液（即1份濃縮病毒抗原加449份洗滌液），20微升的濃縮病毒抗原加入8.98毫升的洗滌液中，工作用的病毒抗原就配置好了。

血清稀釋板加樣操作步驟：試驗以每板20份樣品操作，包被板A1～A10孔各加175微升的樣品稀釋液（1x)，A11、A12、孔各加100微升的樣品稀釋液（1x)。B1～B12、C1～C11、D1～D11、E1～E10孔各加175微升的樣品稀釋液（1x)，E11孔F1～F11、G1～G11、H1～H11孔各加100微升的樣品稀釋液（1x)。

包被板A1～A10孔分別加入待檢牛血清樣品S1～S10樣品25微升，E11～E20孔分別加入待檢牛血清樣品S11～S20樣品25微升，A11孔加100微升的陽性對照，A12孔加100微升的陰性對照，用排槍吹打混勻（每孔吹打10次），待檢A11以100微升的量從A到H連續2倍稀釋，陰性對照A12以100微升/孔的量從A到B連續2倍稀釋。

待檢牛血清樣品A1～A10、E1～E10在第A1～10、E1～10列從1∶8稀釋至1∶1024，陽性對照從1∶2稀釋至1∶256。由于試劑盒提供的陽性對照已1∶8稀釋，則變為從1∶16稀釋至1∶2048，陰性對照從1∶2稀釋至1∶4。將以上稀釋好的溶液，用多道移液器從血清稀釋板上按照次序轉移至包被板上的對應孔，50微升/孔，每個樣品使用1個單獨的槍頭。

加入按比例已經稀釋好的病毒抗原，1～11列每孔各加入50微升，A12、B12每孔各加入50微升，E12、F12、G12、H12每孔各加入100微升，用振蕩器混勻，貼封板膜，放入已經調試好的37℃恒溫箱溫育30分鐘。加樣完畢后，所有稀釋度翻倍，待檢樣品從1∶16～1∶2048，陽性對照從1∶32～1∶4096，陰性對照從1∶4～1∶8。

從恒溫箱取出包被板，取出過程中要避免手指碰到包被板孔下底，避免影響OD值，把包被板內每個孔里的液體甩出，然后用300微升的多道移液器調至280微升后，吸入已經配好的洗滌液，洗滌包被板內每孔，一共洗包被板5次。每次洗滌后都甩去孔內的液體。在最后一次包被板洗滌液棄去后，把孔里留下的洗滌液在準備好吸水紙上拍干。

將洗好的板里加入抗體溶液每孔50微升，再加入酶結合物每孔50微升，用振蕩器混勻，貼封板膜，放入已經調試好的37℃恒溫箱溫育30分鐘。從恒溫箱取出包被板，如上面一樣洗板，然后把孔里留下的洗滌液在準備好吸水紙上拍干。

試劑盒里的顯色液A取出6毫升，顯色液B取出6毫升，在避光環境里混勻后，每孔加入100微升，放入37℃恒溫箱避光溫育15分鐘。取出包被板，各個孔加入終止液50微升。放入酶標儀，最后在（450納米）測量讀取OD值。

4 試驗成立判斷

因為臨界值等于0.937，病毒抗原對照OD值大于1.0，標準陽性對照抗體效價在1∶1024±1之間，標準陰性對照抗體效價小于1∶8，所以，本次試驗成立。

5 最終結果判定

因為抗體效價≥1∶128，判為陽性；抗體效價≤1∶64，判為陰性；抗體效價與牛攻毒保護關系為牛，抗體效價≥1∶128，99%以上保護；抗體效價≤1∶16，不保護；抗體效價在1∶22～1∶90，50%保護。樣品S1～S20，除S8外，其余樣品抗體效價均大于1∶128，為抗體陽性，S8抗體效價小于1∶16，抗體陰性，所以，S8牛抗體不能夠起到保護作用，需要進行O型口蹄疫疫苗免疫。

綜上，O型口蹄疫ELISA試驗的抗體檢測，可以幫助養殖戶及時做好免疫風險評估，避免免疫率下降后發病而造成的經濟損失。因此，做好抗體檢測工作非常有必要。