高效液相色譜法檢測微擬球藻中磷脂類化合物含量

劉耘琿，周真真，陳 林，張俊杰，叢 威

（1.江蘇海洋大學，江蘇 連云港 222000；2.中國科學院過程工程研究所，北京 100089；3.中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101）

微擬球藻（Nannochloropsis sp.）是一種高附加值光合藻類微生物，能夠通過光合作用合成脂質、蛋白質、葉綠素和類胡蘿卜素等高價值產物[1]。該藻種總脂含量可達干重的30%~50%[2-5]，其中磷脂的含量可達30%[6]，同時還富含大量的ω-3 系列的多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），具有預防心血管疾病等功能[7-9]，相比傳統油料作物中提取的磷脂，微擬球藻所提取的磷脂具有更高的營養價值。因此，深入研究微擬球藻中磷脂的組成，對于后期磷脂產品的開發和利用具有重要意義。

目前，磷脂檢測主要采用高效液相色譜法，這種方法具有便捷高效且準確的優點[10-17]。由于磷脂是一種親水性物質，因此使用HILIC 反相分離模式的ZORBAX RX-SIL 色譜柱能夠有效地分離微擬球藻磷脂的各個組分。微擬球藻磷脂含有長鏈、高度不飽和的脂肪酸基團，并且含有較高的細胞色素、蛋白質和多糖等雜質。采用大豆或雞蛋等傳統的磷脂檢測方法可能會影響檢測的準確性。因此，針對微擬球藻磷脂體系，建立高效液相色譜分析方法具有重要意義。

本研究使用ZORBAX RX-SIL 色譜柱和紫外檢測器對磷脂組分進行分離檢測，考察了不同的流動相對磷脂的檢測效果，以期建立高效且準確的微擬球藻磷脂檢測方法，對微藻源磷脂的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微擬球藻（山東煙臺海融生物技術有限公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma 公司）；磷脂酰肌醇（PI，批號H2219476，純度大于99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷脂酰乙醇胺（PE，批號E2113225，純度大于99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷脂酰膽堿（PC，批號D2101126，純度大于98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；溶血磷脂酰膽堿（LPC，純度大于99%，批次C2212077，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；硅膠固相萃取柱（Waters Sep-PakTM 6cc 500 mg）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200 Ⅱ高效液相色譜儀帶紫外檢測器（美國安捷倫公司）；FA2004 電子分析天平（上海精科儀器有限公司）；NK200-1B 氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；旋轉蒸發儀；TGL-16C 冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準儲備液的配制

分別精密稱取磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿標準品25 mg 置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至25 mL，此時配制的標準儲備液中磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的濃度均為1 mg/mL。分別取上述4 種標準品1 mL 配制成混合標準溶液。

1.3.2 標準工作曲線溶液的配制

精密吸取上述磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿標準儲備液，用甲醇稀釋，分別配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的標準溶液。

1.3.3 微擬球藻磷脂樣品的制備

微擬球藻藻粉經膨化后得到微擬球藻膨化顆粒，首先取100 g 膨化后的藻粉，加入300 mL 95%乙醇，放置于磁力攪拌器上，在60 ℃的條件下500 r/min 提取1 h，然后離心樣品收集上清液；再向膨化藻粉沉淀中加入100 mL 95%乙醇，重復上述提取過程2 次，合并上清液。最后使用0.22 μm 有機系過濾器過濾，將濾液置于旋轉蒸發儀中去除溶劑，得到微擬球藻油脂。

稱取約50 mg 上述油脂樣品，溶于1 mL 氯仿準備上樣。取硅膠小柱，先用10 mL 甲醇活化，再加入30 mL 氯仿平衡，然后將油脂樣品上樣。經過25 mL 氯仿、20 mL 丙酮和15 mL 甲醇先后洗脫，分別獲得中性脂、糖脂和磷脂組分，收集磷脂組分，利用氮吹儀除去磷脂組分中的溶劑，并烘干至恒重[18]。最后精密稱取10 mg微擬球藻磷脂，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，置于冰箱-20 ℃保存備用。

1.3.4 儀器參考條件

色譜柱為ZORBAX RX-SIL 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長205 nm；流動相為甲醇、甲醇-乙腈溶液（50∶50，V∶V）和甲醇-水溶液（87∶13，V∶V），等度洗脫；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.3.5 精密度實驗

取4 種磷脂混合標品重復進樣3 次，分別測得峰面積并計算RSD 值，檢測儀器的精密度。

1.3.6 加標回收率實驗

取已制備好的已知濃度的微擬球藻磷脂樣品溶液，向其中加入已知質量的磷脂標準品，制成低、中、高3 種濃度加標回收樣品，分別進樣平行測定3 次，計算磷脂的加標回收率。

1.3.7 數據分析

采用色譜處理軟件，根據色譜圖中樣品的保留時間和標準品的保留時間比對進行定性分析，根據各磷脂的峰面積和標準曲線對樣品中的磷脂進行定量分析。用Microsoft Excel 2016、Origin 9.8 軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

考察甲醇、甲醇-乙腈溶液、甲醇-水溶液作為流動相對微擬球藻磷脂樣品中4 種目標物質的影響。由圖1可知，當采用甲醇-乙腈溶液（50∶50，V∶V）作為流動相時，2~3 min 處的峰無法較好地分離，且目標物的保留時間加長，峰形較差；當采用甲醇作為流動相時，2~3 min處的峰無法較好地分離，并且檢測時間較長，需要15 min；當采用甲醇-水溶液（90∶10，V∶V）作為流動相時，基線平穩，目標峰形較好，且檢測時間縮短至8 min 以內。因此，選用甲醇-水溶液作為流動相進行后續的實驗。

圖1 微擬球藻磷脂樣品在不同流動相下的液相色譜圖

2.1.2 流動相比例的選擇

考察流動相為甲醇-水溶液時水的比例分別為5%、10%、13%、15%、20%時對微擬球藻磷脂樣品中4種目標物質的影響，結果如圖2 所示。隨著水的比例增加，樣品中目標物的保留時間縮短。當水的比例較低時，2 min 處的PI 無法有效分離；當水的比例過高時目標物的峰會發生重疊。因此，選擇水的比例為13%進行后續實驗。

圖2 微擬球藻磷脂樣品在不同甲醇-水比例下的液相色譜圖

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系、檢出限與定量限

精密吸取標準工作曲線溶液進樣測定，以各個標準品質量濃度（X）為橫坐標，對應的峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程見表1，4 種組分在0.1~1 mg/mL 的范圍內線性關系良好，相關系數大于0.996 8；分析方法的定量限和檢出限由信噪比（S/N）計算，檢出限定義為S/N=3 時對應的分析物濃度，定量限定義為S/N=10 時對應的分析物濃度，分別計算4 種組分的檢出限和定量限。

表1 各磷脂組分的線性方程、范圍、相關系數、檢出限及定量限

2.2.2 精密度

精密度結果見表2，結果顯示4 種磷脂標準品的相對標準偏差（RSD）均小于0.48%，重現性良好。

表2 磷脂標準品精密度實驗結果

2.2.3 回收率

回收率結果見表3，在不同添加水平下，4 種磷脂標準品的回收率在85%~105%，相對標準偏差（RSD）小于3.1%，有較好的準確度。

表3 磷脂標準品加標回收率實驗結果

2.3 樣品檢測

按照1.3 中的方法對微擬球藻磷脂樣品進行檢測，檢測峰面積代入線性回歸方程中計算磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的含量，結果見表4。計算結果為磷脂酰肌醇含量為19.32%，磷脂酰乙醇胺含量為18.74%，磷脂酰膽堿含量為11.86%，溶血磷脂酰膽堿含量為3.24%。

表4 微擬球藻磷脂中PI、PE、PC 和LPC 含量

3 結論

在研究制定高效液相色譜方法時，流動相的選擇是影響分離效果的關鍵因素之一[19]。為了分析微擬球藻磷脂類化合物的組成，本研究建立了一種以甲醇-水（87∶13，V∶V）為流動相，采用ZORBAX RX-SIL 色譜柱和紫外檢測器的反相高效液相色譜法。結果表明，微擬球藻中最主要的4 種磷脂類化合物磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿含量分別為19.32%、18.74%、11.86%和3.24%。經過方法學驗證，該檢測方法的加標回收率在85%~105%之間，靈敏度較高，檢測時間較短，分離度較好，且具有良好的穩定性，適用于微藻磷脂的測定。