循環腫瘤細胞在胃癌中應用的研究進展

王劉星，王黔，2

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一。據估計，2020年全球約有1 930萬新發癌癥病例和近1 000萬癌癥死亡病例。其中胃癌占新發病例的5.6%。占死亡病例的7.7%［1］。而在我國，胃癌的發病率和病死率分別位于所有惡性腫瘤的第二位及第三位，遠高于世界平均水平［2］。近年來，新輔助治療、靶向治療、免疫治療等［3-5］新方式的出現，改善了部分胃癌病人的預后，但胃癌5年生存率仍然低下，其中最主要的原因是我國大多數病人確診時已是晚期［6］。所以，尋找一種能大規模篩查、診斷胃癌以及動態監測胃癌治療敏感性的方法尤為重要。

液體活檢是近年來癌癥研究領域的熱點之一，液體活檢是一種強大的技術，可應用于癌癥篩查和治療的不同階段。在無癥狀人群中，可用于識別癌癥病人，以提高早期診斷和更好地干預，同時可提供胃癌病人動態發展信息及治療敏感性［7］。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）檢測作為液體活檢最主要的組成之一，是推動精準醫學的重要技術。與普通侵入式的組織活檢及細胞學檢查相比，CTC檢測具有一系列的優勢，如標本獲取容易、可反復檢測等。同時，與另一種液體活檢方式——循環腫瘤核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測相比，CTC作為完整的腫瘤細胞，能夠提供腫瘤的基因組、轉錄組、蛋白質組及代謝組等多種信息［8］。同時可以在體外進行腫瘤細胞的分析［9］。故本研究搜集近幾年的相關文獻，就CTC在胃癌臨床應用中的相關研究進展作一綜述。

1 CTC及其檢測

CTC最早由澳大利亞病理學家Ashworth［10］于1869年發現，從原發腫瘤或相應的遠處轉移部位釋放到循環血液中的腫瘤細胞統稱為CTC［11］。大部分在短期內即發生凋亡或被吞噬，其中的一小部分，稱為播散性腫瘤細胞，到達遠處的器官，在那里它們可以作為休眠的單個腫瘤細胞或形成臨床前期的微轉移［12］。同時，存活下來的極少部分CTC可以相互聚集形成循環腫瘤細胞微栓（circulating tumor microemboli，CTM）［13］。最近的研究表明，CTM可能不僅僅是CTC的聚集物，而是與單一的CTM相比，包含CTM的細胞表現出獨特的表型和分子特征［14］。此外，在許多病例中，與單個CTC相比，CTM表現出更高的轉移潛能和對凋亡抵抗，轉移風險是單個CTC的23～50 倍［14-15］。

腫瘤的進展與上皮-間質轉換（EMT）有關。EMT可能參與了癌癥干細胞的形成，免疫監督的逃逸，以及化療和靶向治療耐藥機制的產生。CTC代表了癌癥播散的第一個關鍵環節，而CTC也在EMT的幅度上表現出了一定程度的表型異質性。CTC上皮標志物表達在EMT過程中會發生下調，甚至消失，根據EMT標志物的表達可將CTC分為上皮型［表達上皮鈣黏素、上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、細胞角蛋白（cytokeratin，CK）等］、間質型CTC（表達神經鈣黏素、波形蛋白、snail蛋白等）、混合型CTC（同時表達上皮和間質標志物）［8］。而混合型CTC根據上皮標志物和間質標志物的比例又可以分為3類（上皮標志物＞間質標志物、上皮標志物=間質標志物、上皮標志物＜間質標志物）。CTC不同的EMT表型代表了腫瘤進展的不同階段［16］。腫瘤細胞播散的上皮-間質/間質-上皮假說很好的解釋了這一點，一些腫瘤細胞通過EMT過程來逐漸與周圍腫瘤細胞分層，分層的腫瘤細胞隨著血液循環，侵入到間質之中，再通過MET過程使這些腫瘤細胞重新生長，形成轉移灶［17］。大量研究［18］支持了這一觀點，同時也發現間質型CTC以及間質標志物占主導的混合型CTC提示腫瘤病人不良的預后，通過動態監測CTC的EMT表型可反映治療的敏感性。

CTC早在1869年就被首次報道，但對于CTC的研究卻停滯了一百多年。主要是因為CTC，特別是CTM在外周血中的含量僅1～1 000個細胞/10毫升［19］，同時缺乏分離它們的技術。直到2004年，隨著CellSearch?的出現，這一點成為可能，這是一個專門用于血液樣本中CTC計數的工具。該技術是基于用抗EpCAM、各種細胞角蛋白和CD45的抗體標記血液有核細胞。它是美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的作為臨床CTC檢測的唯一技術。然而這種技術也存在一定缺陷，并不是所有的CTC都表達這些標志物，這也是CTC在臨床應用中的最大阻礙。其他的一些檢測手段通過利用CTC的大小、密度及電荷特性等獨特的物理特性。對于CTC的檢測，人們不僅僅滿足于CTC計數，CTC的EMT表型及分子分型更加受到科學家們的重視。CTC分子分型目前主要包括基于定量PCR（qPCR）、反轉錄（RT）-qPCR及多重RT-qPCR的方法，基于影像學的方法及微濾器和微芯片設備等［20］。然而不管是計數檢測方法還是分子分型檢測方法，因其檢測手段的差異性，其結果不盡相同，因此，尋求一種高特異性及敏感性的檢測手段仍是科學家們的不懈追求。

2 CTC與胃癌

2.1 CTC在胃癌診斷中的應用 胃癌給我國造成了巨大的社會和經濟負擔。當前，我國胃癌的早期診斷率不足10%。胃鏡+組織病理活檢是診斷胃癌的“金標準”，由于其有創性，不適合大規模用于疾病的篩查。目前，臨床中用于胃癌早期檢測的最常見的腫瘤標志物包括癌胚抗原、碳水化合物抗原（CA）-CA199、CA724、CA125、CA242以及甲胎蛋白［21-22］。然而，這些血清生物標志物的特異性和敏感性較差，現有的用于胃癌診斷和預后的循環生物標志物的敏感性和特異性較低，而胃癌的診斷標準僅基于胃鏡等侵入性操作。人們急迫需要一種更簡單而無創的檢測，但也需要高度特異性的生物標志物。

Lee等［23］的研究結果顯示，超過80%的早期胃癌病人中檢測到CTC，當確定每7.5毫升外周血中CTC計數≥2為CTC陽性，區分胃癌病人與對照組的特異度和靈敏度分別為90.3%［95%CI：（75.6%，97.4%）］和85.3%［95%CI：（81.4%，87.2%）］。而癌胚抗原及糖類抗原（CA）-199等傳統腫瘤標志物在胃癌中的陽性率不足40%。另外，也有多項研究報道，在＜1 mm腫瘤的病人外周血中就能檢出CTC［24-25］。而通常的影像學檢查大多僅能檢出1 cm的腫瘤，對早期胃癌的診斷率不足50%。所有這些結果都提示CTC在胃癌早期診斷中的巨大潛力。然而，另有薈萃分析得出，對各種CTC檢測方法的診斷準確性分析，CTC對胃癌的綜合靈敏度和特異度分別為42%［95%CI：（21%，67%）］和99%［95%CI：（96%，100%）］［26］。CTC對胃癌的敏感性較低，文獻產生這些差異可能歸因于人群選擇、地域差異、標本選擇以及CTC檢測方法的不同，因此，急迫需要大樣本、多中心的高質量研究來證實CTC在胃癌早期診斷中的價值。CTC檢測技術的發展也有望解決這一問題。目前，仍需要加強公眾的防癌意識來進一步提高我國的早期胃癌診斷率。

2.2 CTC在胃癌治療中的動態監測 胃癌的治療是以手術為主的綜合治療。單純一種治療手段都難以有良好的治療效果。目前監測胃癌治療后有效或疾病進展的主要手段為影像學檢查，但影像學檢查對胃癌的監測具有滯后性及不準確性，如原發腫瘤體積發生了改變才能識別，無法辨識8 mm以下的小淋巴結轉移及對腹膜轉移的發現難度較大等［27］。尋求一種合適的評估胃癌治療敏感性、動態監測胃癌治療后的疾病轉歸的方法，對于病人治療后疾病出現進展的早發現、早治療具有深遠意義［28］。

一項薈萃分析顯示，CTC低的結直腸癌病人的疾病控制率顯著高于CTC高的病人［RR=1.354，95%CI：（1.002，1.830），P=0.048］，CTC低的病人往往有良好的化療反應率［29］。Zhu等［30］研究發現，治療前后CTC陽性和CTC陰性之間差異有統計學意義（中位生存期12.6個月比31.6個月，P＜0.001；中位生存期12.4個月比24.2個月，P=0.002）。兩個療程化療后，進展組（P=0.002）CTC數量明顯增加，而非進展組CTC數量明顯減少（P=0.020）。因此，CTC計數的變化與治療反應（P=0.004）密切相關。這些研究提示在胃癌、結直腸癌病人的治療過程中，治療后CTC計數增加往往提示效果欠佳，同時預示著不良預后。根據間質型CTC來實時監測治療療效可能更加準確。然而，有文獻報道，在接受治療的胃癌病人中，有部分病人CTC數量呈現增多趨勢，但間質型CTC卻呈現減少的趨勢，最終病人臨床緩解，而另一部分病人治療后CTC數量減少，但間質型CTC卻增多，最終這部分病人出現臨床進展［31］。在治療療效評估上，CTC檢測特別是間質型CTC的數量變化可能比影像學檢查更早提示治療療效，進行實時評估［32］。

胃癌與結直腸癌同屬消化道實體腫瘤，具有一定的相似性。通過CTC數量及其表型數量的變化來動態監測胃癌治療療效仍需更多的高質量的研究來證實。綜合上述研究提示，在腫瘤的化療過程中，CTC數量增加特別是間質型CTC數量的上升表明了一般的化療耐藥性，而早期轉向替代化療方案一般是沒有價值的。在一個周期化療后發現有CTC，特別是間質型CTC數量增加的病人應該強烈考慮在進展時更換治療方案。

2.3 CTC指導胃癌的個體化治療 CTC檢測技術是精準醫學的重要組成部分之一。如前所述，CTC是一個完整的腫瘤細胞，反映了腫瘤的異質性，可以用來研究和靶向原發性和/或轉移性腫瘤的進化突變情況［33-35］。活的CTC可獲得腫瘤的遺傳和表觀遺傳特性。此外，培養中的CTC可能有助于篩選敏感的藥物，并在新興的精準醫療和靶向治療方案中做出重要的治療決策。目前，CTC的特征已經在不同的腫瘤類型上進行，這并不限于乳腺癌、前列腺癌，還包括胃癌。例如，人類表皮生長因子受體2（HER2）的擴增是20%胃癌的主要原因。它被認為是轉移性胃癌病人的生物標志物之一。HER2狀態過表達的病人通常接受HER2靶向治療［36-37］。

Daisuke等［38］共納入105例轉移性或復發性胃癌病人，所有病人均采用CellSearch系統檢測CTC中HER2的表達情況。105例病人中有65例（61.9%）檢測到CTC，共分為三組：A組，組織學HER2陽性；B組，組織學HER2陰性和CTC上HER2陽性；C組，組織學和CTC上HER2陰性。病人接受卡培他濱+順鉑治療。A組和B組另外給予曲妥珠單抗治療。在HER2的表達中，腫瘤組織與CTC無相關性。即使B組沒有組織學HER2表達，B組顯示良好的預后與A組一樣，C組的總體生存率明顯低于A組和B組。多變量分析表明，CTC表達HER2是整體和無進展生存時間的一個獨立預后因素。該研究顯示，曲妥珠單抗聯合化療在CTC上HER2陽性病人中具有潛在的臨床應用價值，即使在組織學上是HER2陰性的。在胃癌病人中，Li等［39］報道了組織學HER2陽性和HER2陰性原發腫瘤病人中外周血CTC HER2陽性發生率分別為91.0%和76.2%。上述這些結果提示原發腫瘤與外周血中CTC存在異質性。因此，胃癌組織學HER2陰性的病人須進一步檢測外周血中CTC HER2表達情況，綜合兩者HER2表達情況，選擇使用曲妥珠單抗進行HER2靶向治療。另外，隨著CheckMate 649研究結果的公布［40］，免疫治療被提上進展期胃癌的一線治療，選擇免疫治療的優勢人群也是目前的研究熱點。程序性死亡受體配體1、腫瘤突變負荷、微衛星不穩定、腫瘤浸潤淋巴細胞及調節性T細胞等是目前免疫治療的常用生物標志物［41］。通過CTC來進行這些生物標志物的檢測可能也是未來研究的一個方向。從而進行靶向、免疫的個體化治療。

2.4 CTC在判斷胃癌預后中的作用 復發和轉移是導致胃癌術后低生存率的主要原因［42］，尋找判斷預后的預測因子，評估胃癌病人的預后極為重要。CTC與胃癌的復發和轉移密切相關，有潛力作為判斷胃癌病人生存期的生物標志物。Ito等［43］在胃癌術前進行CTC檢測，得出CTC計數5個以上的病人無復發生存期顯著低于CTC計數5個或以下的病人（P=0.034）。Uenosono等［44］研究多變量分析顯示CTC是進展期胃癌病人總生存期的獨立預后因子（P=0.024）。這些研究顯示CTC可以用來判斷胃癌病人的預后。如前所述，上皮-間質/間質-上皮在CTC的遠處轉移中具有十分重要的意義，在Ito等［43］的研究中，外周血中CTC計數5個以上的病人與CTC計數5個或5個以下的病人的總生存期差異無統計學意義（P=0.183）。提示CTC總的計數尚不能精準地判斷胃癌病人的預后，Satelli等［45］認為，間質型CTC計數似乎是轉移性乳腺癌預后的一個強有力和可靠的預測因子。因而，結合CTC總的計數及間質型CTC計數來綜合判斷胃癌病人的預后是一個不錯的選擇，治療前CTC計數高且間質型CTC陽性預示著不良預后。

除CTC外，CTM也可用于輔助判定胃癌病人的預后。Chen等［46］研究顯示，治療前CTM陽性（≥1 CTMs/6 mL）與肝轉移的發生相關。進一步了解CTM的大小的異質性表明，具有不同簇大小的CTM可能對胃癌的預后有不同的貢獻。CTM2是胃癌-CTM的主要亞型，而CTM3-4是特異性亞型，與較低的無進展生存期和總生存期顯著相關。但CTM在胃癌病人外周血中的檢出十分稀少，且胃癌病人在檢出CTM時大多已是Ⅳ期［47］，故CTM用于判斷胃癌預后的實際意義有限，需要更加先進的CTC檢測技術來提高CTM的檢出率。

3 總結與展望

CTC具有無創性、可重復檢測、可提供腫瘤多組學信息等優點。已有多項研究數據顯示，CTC在胃癌的早期診斷、治療過程中的動態監測、預后的判斷及個體化治療中顯示出了巨大的優勢。然而，盡管用于分離和分析CTC的技術在過去十多年中得到了飛速發展，但被廣泛認可的技術卻很少，目前，迫切需要開發一種統一、標準化和自動化的方法來檢測CTC及其分子和遺傳學分析。

需要進行更多的基礎研究來提供更多關于CTC的生物學信息來確定對惡性腫瘤的增殖和轉移的重要機制。此外，這些研究有望通過揭示與胃癌病人的藥物敏感性和耐藥性相關的分子生物學靶點，在精準醫學中發揮重要作用。同時，也需要大量多中心、大樣本、多種族的臨床研究來為CTC在胃癌中的規范應用提供更多的循證學依據。