幽門螺桿菌對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道黏膜炎癥的影響*

張夢麗，戈改真，丁瑞峰，王樂樂，忻曉霞，王兆霞

（1.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014010；包頭醫學院第一附屬醫院 2.呼吸二科，3.消化科，內蒙古 包頭 014010）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一種異質性肺疾病，以慢性呼吸道癥狀（呼吸困難、咳嗽、咳痰）為特征，是由于氣道異常（支氣管炎、細支氣管炎）和/或肺泡異常（肺氣腫）導致的持續性、通常是進行性的氣流阻塞[1]。大約全世界一半的人口均存在幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）感染，其與胃炎、胃潰瘍、胃癌等消化系統疾病密切相關，被認為是一級致癌物。目前研究表明，Hp除與胃腸道疾病有關，還與胃腸外多系統疾病相關，包括呼吸系統疾病、血液系統疾病、心血管系統疾病、神經系統疾病等[2]。Hp感染與COPD疾病有關，但是其機制并未闡明。COPD發病機制至今未完全明確，氧化應激、炎癥反應被認為與該病的發展密切相關。本研究擬觀察Hp對COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）炎癥因子白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）和腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）的影響，探討Hp是否會加重氣道炎癥，從而影響COPD疾病的發生、發展，以及Hp影響COPD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及動物

1.1.1 Hp菌株 采用國際統一的悉尼菌株1（SS1）標準菌株（山東大學提供）。

1.1.2 主要試劑 脂多糖（美國Sigma公司，貨號：L2880），IL-6（批號：20221206E7）、IL-8（批號：20221206C2）、TNF-α（批號：202212053V）酶聯免疫吸附試驗試劑盒（江蘇寶萊生物科技有限公司），香煙（云煙牌，焦油量11 mg，煙氣煙堿量1.1 mg），水合氯醛（北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YT0533）。

1.1.3 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠25只，8周齡，體重（240±10）g [北京斯貝福生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0030]。飼養溫度為22～24 ℃，相對濕度為35%～45%，晝夜時間均等，自由進食水。本實驗嚴格參照動物實驗倫理要求相關規定進行，且獲得醫院倫理委員會審批同意[批號：包醫倫審動物2021第（041）號]。

1.2 儀器與設備

C-400大鼠煙熏箱（上海晟廷生物科技有限公司）、AniRes2005肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司）、RT-6100酶標儀（美國Rayto公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 25只大鼠隨機分為Hp+ COPD組11只，COPD組11只，空白對照組3只。

1.3.2 復制COPD大鼠模型 所有大鼠適應性喂養1周，將Hp+COPD組與COPD組大鼠置于煙熏箱內，每次10支煙，上下午各1次，每次煙熏1 h。第1、14天用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，在動物喉鏡輔助下暴露聲帶，可視下灌入1 mg/mL 脂多糖溶液200 μL，旋轉大鼠，使LPS溶液均勻散布于兩肺。空白對照組在第1、14天氣管內滴注生理鹽水200 μL，其余時間不做任何處理。

1.3.3 COPD大鼠觀察指標 模型復制后4周，隨機選取COPD組大鼠3只和空白對照組大鼠3只，腹腔麻醉后剪開頸部皮膚，暴露氣管，連接小動物肺功能儀檢測肺功能，記錄用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、0.3秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.3 second,FEV0.3）、0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV0.3/FVC）、呼氣流量峰值（peak expiratory flow,PEF）。

1.3.4 復制Hp大鼠模型 將-80 ℃ Hp國際標準菌株SS1復蘇后，經尿素酶、脲酶、革蘭染色驗證后，接種于平板培養基上，置于37 ℃微需氧環境培養72 h，每24 h換氣1次。用生理鹽水配置成1×1011CFU/L的Hp菌液備用。Hp+COPD組大鼠禁食水12 h，用5 g/L NaHCO3做灌胃預處理，預處理后禁食不禁水6 h，經口灌注1×1011CFU/L的Hp菌液1.5 mL，灌胃結束后禁食水4 h，隔天灌胃1次，連續灌胃5次。COPD組大鼠經相同預處理后灌胃同等劑量的生理鹽水。

1.3.5 Hp模型的檢測 模型復制后4周，隨機選取3只Hp+COPD組大鼠，取胃竇部黏膜行細菌學涂片檢測及快速尿素酶試驗。

1.3.6 收集大鼠BALF 將Hp+COPD組與COPD組各剩余8只大鼠麻醉后打開胸腔，結扎右主支氣管，在4、5氣軟骨之間行一2 mm橫切口，將外徑約1.8 mm的大鼠氣管插管進入氣道約2 cm，灌注4 mL生理鹽水進入左肺，輕揉左肺，緩慢回抽，重復3次，收集BALF，回收率約為80%，3 000 r/min離心 5 min，收集上清液置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以均數標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空白對照組和COPD組大鼠的肺功能

空白對照組和COPD組大鼠的PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P<0.05）；COPD組PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC均降低，提示COPD模型復制成功。見表1。

表1 空白對照組與COPD組大鼠肺功能比較（n=8，±s）

表1 空白對照組與COPD組大鼠肺功能比較（n=8，±s）

組別空白對照組COPD組t 值P 值PEF/（mL/min）51.45±2.43 42.17±2.92-4.229 0.013 FEV0.3/mL 12.64±0.31 3.56±1.36-11.240 0.000 FEV0.3/FVC/%78.92±1.16 41.44±7.64-8.402 0.001

2.2 Hp+COPD組大鼠胃黏膜組織檢查結果

將Hp+COPD組大鼠胃竇部黏膜面分為兩部分，一部分貼于載玻片上進行涂片，革蘭染色后鏡檢，可檢測出紅色短桿狀菌體（見圖1A）；另一部分進行快速尿素酶試驗，出現紅色提示結果呈陽性（見圖1B）。2種結果均為陽性，提示Hp+COPD組大鼠幽門螺桿菌定植模型復制成功。

圖1 幽門螺桿菌涂片及快速尿素酶試驗結果

2.3 Hp+COPD組與COPD組大鼠炎癥因子比較

Hp+COPD組與COPD組大鼠BALF的IL-6、IL-8、TNF-α水平比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P<0.05）；Hp+COPD組的IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于COPD組。見表2。

表2 Hp+COPD組與COPD組大鼠炎癥因子水平比較（n=8，pg/mL，±s）

表2 Hp+COPD組與COPD組大鼠炎癥因子水平比較（n=8，pg/mL，±s）

組別Hp+COPD組COPD組t 值P 值IL-6 87.51±7.66 51.20±14.13 6.387 0.000 IL-8 188.73±6.83 103.33±15.36 14.367 0.000 TNF-α 227.78±33.16 150.40±19.82 5.666 0.000

3 討論

1983年Hp在胃黏膜中被首次分離發現，并證實與胃炎、消化系統潰瘍、胃癌等疾病密切相關，越來越多的研究證明Hp感染與胃腸外疾病也密切相關，也包括呼吸系統疾病。其中，Hp和COPD的相關性更是引起了醫務人員的重視。COPD患者Hp感染率及血清抗體陽性率較對照組增高，Hp感染可能促進穩定期COPD患者病情的進展[3]，加重急性加重期COPD患者的肺功能和凝血功能障礙，Hp感染與COPD嚴重程度有關[4]。根除Hp可以改善肺功能，減少COPD急性發作次數[5]。但是Hp感染影響COPD的機制并不清楚。IL-6作為一種炎癥因子，與大量肺內和肺外炎癥性疾病相關，參與COPD氣道及肺實質的炎癥反應、氣流受限及氣道重塑[6]。IL-8可趨化、激活中性粒細胞，導致中性粒細胞變形，釋放各種蛋白酶，生成氧自由基，致使氣道上皮細胞損傷、脫落，進而導致氣道內炎癥反應，被證明是COPD急性加重和進展的原因之一[7]。TNF-α是炎癥反應中首先出現的炎癥因子，可激活淋巴細胞、中性粒細胞，影響核因子κB細胞通路，啟動、擴大炎癥級聯反應，并且可通過上調基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9，導致肺氣腫變化[8]。本研究結果顯示，Hp感染使COPD大鼠BALF的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，加重COPD大鼠氣道炎癥，這提示Hp可通過加重氣道炎癥而促進COPD疾病進展。但Hp加重COPD大鼠氣道炎癥的機制并不清楚，筆者分析可能如下所述。

Hp及其毒素誤吸。SAMAREH-FEKRI等[9]在肺癌患者的BALF中檢測出Hp DNA。ARISMENDI等[10]對小鼠經口氣管內灌注Hp懸液，結果顯示，小鼠肺組織炎癥標志物TNF-α、IL-8、IL-1β、基質金屬蛋白酶-9表達增多；病理檢測提示肺結構破壞、肺纖維化，且肺纖維化隨著時間逐漸加重，但是Hp DNA經PCR檢測，強度逐漸減弱，至30 d為陰性。也有研究證明Hp在胃以外的很多部位包括眼睛、皮膚、膽囊定植，但是目前并沒有研究直接從支氣管肺組織中分離培養得到Hp。另外，Hp能夠產生多種酶，包括尿素酶、過氧化氫酶、蛋白酶、磷脂酶等，并釋放促炎癥反應介質，吸入Hp及Hp外毒素能夠引起支氣管系統的組織損傷[11]。Hp空泡細胞毒素A（VacA）被證實存在于人肺中[12]，可能通過核因子κB信號傳導促進IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的產生，誘導內皮細胞凋亡，導致肺損傷[13]。而COPD患者因為急性加重及呼吸科藥物的使用更容易發生胃食管反流。總之，目前研究不支持Hp在肺組織內直接定植，但是可以解釋Hp及其毒素通過吸入或誤吸直接損傷肺組織并導致慢性炎癥。

局部炎癥因子或Hp產物進入循環。Hp定植于胃黏膜上皮細胞，釋放毒素或直接損害黏膜屏障，引起炎癥與免疫反應，導致患者胃液及循環中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8和IL-6水平升高，炎癥因子進入循環，引起胃腸外疾病[14]。另外Hp根據菌株不同分泌不同的外膜囊泡，作為攜帶物質黏附素、毒力因子（CagA、VacA、脲酶、OipA）、代謝蛋白、磷脂、遺傳物質等的功能載體，釋放到胃環境或者通過胃黏膜易位到組織中的免疫細胞甚至循環，間接誘導全身效應[15]。Hp外膜囊泡在體外可以誘導IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α產生，且Hp外膜囊泡穿透胃上皮細胞能力高于細菌。宿主細胞在感染病原體或可溶性物質后，分泌細胞外囊泡[16]。外泌體是直徑40～160 nm的細胞外囊泡，相對較小的尺寸和統一的形狀使外泌體能夠成功地逃脫單核吞噬細胞系統的清除，保護其攜帶物質免受降解，并被遠離其釋放的細胞選擇性地吸收，通過抗原呈遞、免疫激活、免疫抑制、免疫耐受發揮免疫調節作用。外泌體作為CagA載體能夠突破腸屏障進入循環，將CagA輸送到遠處的器官和組織[17]。腸屏障功能障礙時脂多糖陽性的細菌外膜囊泡存在于血漿中，誘導免疫激活[18]。COPD大鼠有腸黏膜屏障結構改變和功能障礙，Hp又可破壞上皮屏障功能，使Hp相關的外膜囊泡、細胞外囊泡、炎癥因子等更容易突破腸屏障進入循環。Hp毒力因子的這種易位方式可以闡明Hp產物參與局部和全身炎癥的進展。綜上，Hp可能通過局部炎癥或者可溶性物質進入循環，導致胃腸外疾病與癥狀。

Hp可能導致患者微量元素的降低。Hp由于在消化道長期定植引起慢性感染，破壞上皮細胞，干擾胃分泌、酸化功能，而影響微量元素（鐵、鋅、葉酸、維生素B12等）的吸收[19-20]。鋅作為多種酶及酶的激活因子，是免疫調節的關鍵元素。鋅可通過調節T細胞功能、抑制IKK活性和隨后的核因子κB信號通路及伴隨的促炎細胞因子基因的表達（如IL-1和TNF-α）而發揮抗炎作用[21]。鋅對黏膜有保護作用，鋅還可以降低人體的炎癥反應與氧化應激[22]。葉酸和維生素B12是真核細胞一碳代謝中必不可少的輔助因子，維生素B12中的Corrin環清除氰化物離子和活性氧。葉酸和維生素B12缺乏與腦、脈管系統、免疫系統、肝臟和胃腸道的炎癥和損傷加重有關。當葉酸和維生素B12缺乏時，巨噬細胞促炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α表達明顯上調，而補充葉酸和維生素B12則明顯減少其表達，補充葉酸和維生素B12患者的血清TNF-α水平較對照組顯著降低[23]。這些研究表明Hp可能通過影響微量元素的吸收而影響機體局部及全身炎癥水平，從而促進COPD病情進展。

Hp感染導致腸道菌群失調而影響機體炎癥狀態。Hp感染與根除均可引起腸道菌群失調[24]。而腸道微生物又與機體炎癥密切相關，腸道菌群可以通過Toll樣受體、核因子κB和髓系分化因子88等多種途徑調節炎癥反應[25]。腸道菌群變化與血清炎癥指標C反應蛋白、IL-6、TNF-α顯著相關，且與雙歧桿菌、乳酸桿菌呈負相關，與大腸桿菌、腸球菌呈正相關[26]。所以Hp可能通過影響腸道菌群而影響機體炎癥反應。

綜上所述，Hp可以導致COPD大鼠氣道炎癥因子水平升高，從而參與COPD發生、進展，這可能與Hp及其毒素誤吸、局部炎癥因子或Hp產物進入循環、微量元素降低、菌群失調相關，根除Hp可能使COPD患者受益。