MicroRNA-29a與冠心病心絞痛患者血管內(nèi)皮損傷及斑塊不穩(wěn)定性的相關(guān)性*

林紅麗，張雪菲，彭慧，黃倩倩，張?jiān)螺x

[青島市中醫(yī)醫(yī)院（青島市海慈醫(yī)院） 干部保健科，山東 青島 266033]

既往多項(xiàng)研究證實(shí)，microRNA-29a（miR-29a）參與機(jī)體多系統(tǒng)疾病如腎小球病變[1]、膿毒癥[2]、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[3]等；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除miR-29a小鼠出現(xiàn)蛋白尿，且腎小球損傷及腎臟纖維化程度加劇[1]。臨床數(shù)據(jù)表明，早期膿毒癥患者外周血中檢出miR-29a表達(dá)明顯上調(diào)，是潛在的診斷膿毒血癥的生物標(biāo)志物，可能也具有預(yù)測(cè)膿毒癥患者臨床預(yù)后的價(jià)值[2]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)miR-29a參與冠心病發(fā)生、發(fā)展，是臨床診斷冠心病的有益生物學(xué)標(biāo)志物，與健康對(duì)照組相比，miR-29a在冠心病患者中表達(dá)增加，且參與冠心病病情進(jìn)展，影響患者心功能，分析機(jī)制可能與miR-29a影響機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。筆者回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miR-29a對(duì)冠心病的影響可能與其參與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。查晴等[5]發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊中miR-16的表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步的病理學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-16促進(jìn)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，加劇泡沫細(xì)胞凋亡。目前針對(duì)miR-29a與斑塊穩(wěn)定性及冠脈血管內(nèi)皮損傷的相關(guān)性研究尚屬空白，闡明miR-29a參與上述病理過程的機(jī)制能夠?yàn)榕R床治療冠心病提供新的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)納入2020年4月—2022年6月于青島市中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科門診住院的冠心病患者120例。其中，男性68例，女性52例；年齡46～81歲，平均（59.03±8.27）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合冠心病診斷[6]；②首次診斷冠心病且自愿入組；③穩(wěn)定型心絞痛定義為特定勞力狀態(tài)下導(dǎo)致胸悶和（或）胸痛等癥狀；④不穩(wěn)定型心絞痛。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性心肌梗死（包括急性ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型心肌梗死）；②存在抗血小板、調(diào)脂等藥物治療禁忌證；③合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全等不適宜入組疾病；④既往接受過冠狀動(dòng)脈介入治療；⑤臨床資料不完整；⑥存在先天性心臟病、反復(fù)且難以控制的心力衰竭及其他累及心血管系統(tǒng)的疾病；⑦雖有冠狀動(dòng)脈血管病變，但平素?zé)o心絞痛等臨床癥狀；⑧妊娠或哺乳期婦女。所有患者自愿入組，入組前獲得充分知情同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（No：20221014002）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 樣本收集 抽取受試者禁食12 h后外周靜脈血，3 000 r/min離心5 min，收集上層血清用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），同時(shí)抽取禁食12 h后靜脈血用于檢測(cè)血脂水平。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-29a表達(dá) 取凍存血清室溫完全解凍后加入TRIzol試劑提取總RNA，通過紫外分光光度儀在波長260 nm處檢測(cè)總RNA濃度和純度合格[4]，備用實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）構(gòu)建cDNA文庫，應(yīng)用TaqMan?Fast Advanced Master Mix試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行qRT-PCR，配制總體積為20 μL的反應(yīng)體系：包括5 μL cDNA，10 μL Master Mix，正向引物和反應(yīng)引物各1 μL（上海生工生物工程股份有限公司），3 μL RNA-free水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因。miR-29a正向引物：5'-CGCGGATC CATGGTTAAAGAGCC-3'；反向引物：5'-CCCAAGCTT TCAGTATAACCATTC-3'，引物長度23 bp；U6正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，引物長度25 bp。miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方式為2-ΔΔCt，每個(gè)樣本均重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1,ESM-1）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1,ET-1）、一氧化氮（nitric oxide,NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1） 取1.2.1中血清，采用ELISA法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ESM-1、ET-1、NO、TNF-α、ICAM-1[7]，檢測(cè)試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室檢查 抽取受試者空腹靜脈血約5 mL送檢至本院中心實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TG）及血肌酐（serum creatinine,Scr）。

1.2.5 冠狀動(dòng)脈CT血管成像檢查評(píng)估冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì) 根據(jù)冠狀動(dòng)脈CT血管成像評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[7]，計(jì)算斑塊CT值，其中CT值< 60 HU為軟斑塊，60 HU≤ CT值<130 HU為纖維斑塊，CT值≥ 130 HU為鈣化斑塊。應(yīng)用寶石能譜CT進(jìn)行冠狀動(dòng)脈成像檢查（德國西門子公司），掃描范圍設(shè)定為主動(dòng)脈弓肺動(dòng)脈起始段至膈肌下1 cm。參數(shù)設(shè)置：管電壓為120 kV，管電流為800 mA，螺距為0.5 mm，層厚0.625 mm，經(jīng)肘正中靜脈推注對(duì)比劑，注射速度3.5 mL/s；依據(jù)冠狀動(dòng)脈CT血管成像檢查將冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊分為穩(wěn)定斑塊（鈣化斑塊和硬斑塊）及不穩(wěn)定斑塊（軟斑塊和混合斑塊）[8]。

1.3 分組

根據(jù)miR-29a mRNA中位數(shù)（miR-29a mRNA=1.13）對(duì)患者進(jìn)行分組，外周血miR-29a mRNA>1.13的患者歸為高miR-29a組（59例），外周血miR-29a mRNA≤1.13的患者歸為低miR-29a組（61例）。根據(jù)患者斑塊性質(zhì)，將患者分為軟斑塊（51例）、纖維斑塊（37例）及鈣化斑塊（32例）。根據(jù)斑塊穩(wěn)定性，將患者分為斑塊穩(wěn)定組（82例）與斑塊不穩(wěn)定組（38例）。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)將患者分為穩(wěn)定型心絞痛組（74例）與不穩(wěn)定型心絞痛組（46例）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

高miR-29a組與低miR-29a組的年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、LDL-C、HDL-C、TG、TC、Scr比較，經(jīng)t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高miR-29a組與低miR-29a組的NO、ET-1、ESM-1、TNF-α及ICAM-1水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高miR-29a組的NO、ET-1、ESM-1、TNF-α及ICAM-1水平高于低miR-29a組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

2.2 miR-29a與斑塊穩(wěn)定性、不穩(wěn)定型心絞痛及斑塊性質(zhì)的關(guān)系

qRT-PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.42±0.51）、（2.09±0.33），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.933，P=0.000）；不斑塊穩(wěn)定組外周血miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量高于斑塊穩(wěn)定組。

qRT-PCR結(jié)果顯示，不穩(wěn)定型心絞痛組與穩(wěn)定型心絞痛組miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（2.27±0.41）、（1.58±0.36），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.656，P=0.000）；不穩(wěn)定型心絞痛組外周血miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量高于穩(wěn)定型心絞痛組。

qRT-PCR結(jié)果顯示，軟斑塊組、纖維斑塊組、鈣化斑塊組的miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（2.41±0.43）、（1.94±0.29）、（1.25±0.27），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.053，P=0.000）。軟斑塊組外周血miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量高于纖維斑塊組及鈣化斑塊組（P<0.05）；但纖維斑塊組及鈣化斑塊組外周血miR-29a mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 miR-29a與冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮因子的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示，miR-29a與ET-1、TNF-α及ESM-1呈正相關(guān)（r=0.471、0.605和0.328，P=0.000、0.041和0.000），但與NO呈負(fù)相關(guān)（r=-0.291，P=0.034）。

3 討論

血管內(nèi)皮損傷是指內(nèi)皮功能或正常形態(tài)受到損傷時(shí)出現(xiàn)功能障礙及變形，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)、血栓聚集、氧化應(yīng)激及血管收縮等病理過程顯著加強(qiáng)，也是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素。持續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[9-11]，因此探討影響血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制有利于降低動(dòng)脈粥樣類疾病的病程進(jìn)展和惡性事件風(fēng)險(xiǎn)。孫定軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a-3p調(diào)控細(xì)胞凋亡等病理生理過程，抑制miR-29a-3p降低了ox-LDL所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，以上結(jié)果提示臨床通過靶向干預(yù)miR-29a-3p治療動(dòng)脈粥樣硬化類疾病有理論基礎(chǔ)支撐。本研究則從臨床病例出發(fā)，探討了miR-29a在冠心病心絞痛患者中的表達(dá)變化，及其與血管內(nèi)皮損傷程度、斑塊穩(wěn)定性、心絞痛發(fā)作情況的相關(guān)性，為后續(xù)開展基因靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，高miR-29a組ESM-1、ET-1、NO、TNF-α均高于低miR-29a組；且miR-29a與ET-1、TNF-α及ESM-1呈正相關(guān)，與NO呈負(fù)相關(guān)。說明循環(huán)miR-29a水平可能是反應(yīng)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷程度的指標(biāo)，提示miR-29a可能具備潛在的損傷冠脈血管內(nèi)皮，加劇病程進(jìn)展的不利影響因素，與既往研究結(jié)果一致[13]。比較可知，斑塊不穩(wěn)定患者miR-29a水平高于斑塊穩(wěn)定患者，不穩(wěn)定型心絞痛患者miR-29a水平高于穩(wěn)定型心絞痛患者；軟斑塊患者miR-29a水平高于纖維斑塊及鈣化斑塊患者，結(jié)果提示高水平miR-29a提示患者有更多的心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，能夠幫助臨床醫(yī)師在診治過程中識(shí)別高危患者，積極給予綜合干預(yù)措施，降低不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，miR-29a與冠心病患者冠脈血管內(nèi)皮損傷及斑塊不穩(wěn)定性具有相關(guān)性，miR-29a表達(dá)越高，血管內(nèi)皮損傷可能越嚴(yán)重，斑塊不穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)越大。后續(xù)筆者將開展相關(guān)研究探討干預(yù)miR-29a對(duì)冠心病的影響，為臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。