不同釀造工藝對黑豆醬油理化特性和感官品質的影響

牛麗麗，崔艷，閆志華，劉先印，劉愷，盧婷，宋茜

（1.天津市利民調料有限公司，天津 300308；2.天津農學院 食品科學與生物工程學院，天津 300384）

醬油，以大豆和小麥為主要原料，經米曲霉、酵母等多種微生物混合發酵而成，是我國最主要的調味品之一[1]。醬油的發酵方式主要有低鹽固態發酵、高鹽稀態發酵兩種[2]。低鹽固態發酵是以脫脂大豆（或大豆）及麩皮、麥粉等為原料，經過蛋白變性、制曲后，混合6° Bé 的鹽水，在45～55 ℃下發酵20～30 d。高鹽稀態發酵是以大豆或大豆粕為主要原料，經過蛋白變性、制曲后，與20° Bé 的鹽水混合成稀醪，在發酵罐中發酵4～6 個月。醬油是日常烹飪的必備品，烹飪時添加適量醬油，會使菜肴色澤誘人、香氣撲鼻、味道鮮美[3]。醬油不僅是一種傳統的調味品，還具有抗氧化等功效[4]。隨著人們生活水平的提高，消費者對更高品質、更高營養價值的醬油產品需求日益強烈。

黑豆中含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、微量元素和粗纖維，具有高蛋白、低熱量的特性。其中蛋白質含量達40%以上，黑豆蛋白質中的必需氨基酸組成結構水平總體優于黃豆[5]。黑豆富含人體所需的氨基酸、維生素和微量元素；其表皮中富含的原花青素（3.61%～5.59%）是一種高效的自由基清除劑，具有保護心血管系統、降血糖、抗腫瘤等作用[6]。黑豆因其活性物質含量高于黃豆，逐漸成為醬油改良的主要原料[7]。

張歡歡等[8]在高鹽稀態發酵工藝下，使用黃豆、黑豆兩種蛋白原料進行發酵，發現黑豆醬油抗氧化活性高于黃豆醬油，醇、酯及醛酮類主要揮發性成分較均衡，風味協調；王猛[9]在黑豆醬油的初步研究中，發現黑豆醬油的氨基酸態氮、全氮、可溶性無鹽固形物的含量均高于黃豆醬油；黑豆醬油中的有機酸含量高于黃豆醬油，特別是乳酸、乙酸、酒石酸。

當前醬油發酵工藝方法較多，不同的發酵工藝有不同的特點，醬油的風味也不同，注重醬油發酵工藝研究并提出醬油風味改善的方法有重要意義[10]。

本文以黑豆為主要蛋白質原料，在發酵過程中設定不同的溫度控制程序，分析不同釀造方式對黑豆醬油品質的影響，為后續黑豆醬油的發酵工藝選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

黑豆：市售；炒小麥：涿州市永鑫炒麥廠；米曲霉（滬釀3.042）：石家莊市鼎鑫釀造食品科學研究所。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉：天津市大陸化學試劑有限公司；甲醛溶液：天津市風船化學試劑科技有限公司；硝酸銀：天津市南開化工廠；鉻酸鉀:天津市天大化工實驗廠；硫酸：天津化學試劑三廠；硼酸：天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸、亞鐵氰化鉀：天津市恒興化學試劑制造有限公司；硫酸銅：天津市化工三廠有限公司；硝酸鉀、次甲基藍：天津市致遠化學試劑有限公司；葡萄糖、酒石酸鉀鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.1.3 設備

T700 型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；PHSJ-5 型實驗室pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；GH610-3 型分析天平：北京京衡偉業科技有限公司；HSY-16 型水浴鍋：上海躍進醫療器械有限公司；101-01 型電熱恒溫干燥箱：天津市三水科學儀器有限公司；JC-9870A 型全自動凱氏定氮儀：上海市沛歐分析儀器有限公司；DN3000 型玻璃鋼保溫發酵罐：連云港中復連眾復合材料有限公司；斗式提升機、泡豆槽及平臺：上海瑞派機械有限公司；蒸球：江陰市華信藥化設備有限公司；三聯發酵罐：鎮江生物設備有限公司；CSOIF 型生物顯微鏡:上海光學儀器五廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑豆醬油發酵工藝

黑豆醬油發酵工藝流程為選豆→浸泡→蒸煮→接菌制曲→發酵→壓榨。

原料配比：黑豆∶炒小麥=7∶3（質量比）。每蒸球用量為黑豆700 kg，炒小麥300 kg。黑豆泡發時間為10～12 h。

蒸煮工藝：泡好的黑豆進入蒸球中蒸煮。蒸煮條件：0.18 MPa、3 min。蒸煮完成的黑豆與炒小麥混合，經隧道冷卻后接種米曲霉菌種，接種量為0.035%。

制曲工藝：曲料入曲池后，溫度控制在30～35 ℃。品溫超過35 ℃時第一次翻曲，10～12 h 后進行第二次翻曲，翻曲后溫度控制在20～25 ℃。68～72 h 后出曲。成曲取樣，測定成曲水分和酶活力等指標。

混料入罐工藝：鹽水濃度為20° Bé，添加酵母培養液的濃度≥2×107cfu/mL，每罐45 L。

分別采用低溫釀造工藝、常溫釀造工藝和高溫釀造工藝3 組發酵工藝進行后續發酵釀造。

1）低溫釀造工藝：鹽水溫度為0～4 ℃，進罐后10～20 ℃保持20 d；隨后開啟熱水循環，緩慢加溫至30 ℃；加入酵母培養液，在30～35 ℃保溫發酵60 d；開啟冷凍機組，溫度控制在25～30 ℃，保溫發酵30 d；醬醪成熟，出罐壓榨。發酵期約為4 個月。

2）常溫釀造工藝：鹽水溫度為常溫（約為25 ℃），進罐后開啟熱水循環，升溫至30 ℃；加入酵母培養，保持30～35 ℃發酵直至結束。發酵期約為4 個月。

3）高溫釀造工藝：鹽水溫度為50～52 ℃，進罐后40～45 ℃保溫發酵20 d；開啟冷凍機組，緩慢降溫至30 ℃；加入酵母培養液，30～35 ℃發酵直至結束。發酵期約為4 個月。

定期取樣，檢測醬汁溫度、pH 值、還原糖、氨基酸態氮、全氮等指標。

1.2.2 相關指標測定方法

酶活力參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中甲醛法測定；總酸、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物、全氮、感官品質參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》測定；還原糖采用SB/T 10213—1994《醬腌菜理化檢驗方法》測定；水分參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》測定；酵母菌計數采用血球計數板計數法；pH 值采用實驗室pH 計直接讀數得出；色值采用比色板直接比對。感官評價標準見表1。

1.3 數據處理

所有樣品均重復測定3 次，采用GraphPrism 8 軟件繪圖。品評數據利用Origin 9.0 繪制雷達圖。

2 結果與分析

2.1 水分和酶活力測定結果

醬油制大曲過程是為了讓米曲霉產生更多種類、更多數量的酶，主要包括水解蛋白質的蛋白酶、肽酶以及分解碳水化合物的酶類，其中米曲霉和蛋白酶活性是影響醬油原料利用率和產品品質的關鍵因素[11]，決定醬油品質好壞和發酵周期長短，曲料中適當的水分含量會對酶的分泌起到促進作用。通常，成曲水分含量在25%～30%，成曲酶活在1～1.3 g 氨基酸態氮/100 g（干基）。本次試驗，分別測定每個試驗組成曲水分和成曲酶活性，以確定3 組發酵工藝是否在成曲質量上保持一致。具體結果見圖1、圖2。

圖1 不同發酵工藝成曲水分含量Fig.1 Moisture content of soy sauce koji in different brewing techniques

圖2 不同發酵工藝成曲酶活力Fig.2 Enzyme activity of soy sauce koji in different brewing techniques

從圖1、圖2 可以看到，3 組的成曲平均水分含量在29%，成曲酶活力平均值為1.25 g 氨基酸態氮/100 g（干基），成曲質量一致，沒有明顯差別。

2.2 不同發酵工藝中醬油理化指標變化

2.2.1 發酵過程中溫度的變化

醬油發酵的溫度與醬油品質密切相關。發酵溫度會影響發酵過程中各種酶活力的變化、微生物的生長[12]及美拉德反應，從而導致醬油的風味、香氣和色澤產生差異[13]。低溫發酵工藝可以模擬自然發酵過程，更適合酵母菌、乳酸菌等有益微生物的繁殖、發酵，醬醪中酒精含量高，能夠生成醇厚的香氣；常溫發酵工藝可以排除投料季節不同而造成的溫度差異，將發酵溫度始終控制在30 ℃左右，在保證酶發揮作用的基礎上，生產出品質均一的產品；高溫釀造工藝初期采用高溫，適合米曲霉蛋白酶發揮作用，使蛋白質快速分解消化，能夠在短時間提升醬油的氨基酸態氮和全氮指標，在短時間獲得濃厚呈味成分。本次試驗每5 d 取樣一次，檢測3 組醬汁發酵過程中發酵溫度的變化，結果見圖3。

圖3 不同發酵工藝醬汁的溫度變化Fig.3 Temperature changes in different brewing techniques

從圖3 可以看出，低溫釀造組發酵溫度在1～20 d，發酵溫度≤20 ℃；21～30 d，發酵溫度控制在15～30 ℃；31～90 d，發酵溫度控制在30～35 ℃；91～120 d，發酵溫度控制在25～28 ℃；常溫釀造組在1～20 d，發酵溫度控制在20～30 ℃；21～120 d，發酵溫度控制在30～35 ℃；高溫釀造組在1～20 d，發酵溫度控制在40～50 ℃；21～30 d，發酵溫度控制在30～40 ℃；31～120 d，發酵溫度控制在30～35 ℃。因此，3 組的溫度變化過程基本符合試驗設定要求。

2.2.2 醬汁pH 值變化

在醬油發酵過程中，醬汁的pH 值變化體現了有機酸的變化規律。在發酵初期，耐鹽乳酸菌利用炒小麥中的碳源代謝成乳酸等有機酸。適量的有機酸對醬油風味具有很大影響，有機酸本身的酸味形成醬油爽口的特殊口感，同時還可以與醇類物質發生酯化。但酸含量過高或分布不平衡會使醬油的口感刺激且不協調[14]。如果通風制曲過程中感染雜菌，由于鹽水不能很快滲透到菌絲旺盛的曲料中，雜菌就會迅速繁殖、產酸，使醬醪pH 值異常下降。醬汁pH 值過低會對各種酶反應、谷氨酸鈉的生成、氮的利用等產生不良影響。3 組樣品中的pH 值變化見圖4。

圖4 不同發酵工藝醬汁pH 值變化Fig.4 pH changes in different brewing techniques

從圖4 可以看出，在醬油發酵前期，pH 值的降低幅度為高溫釀造組＞常溫釀造組＞低溫釀造組。這是因為發酵前期醬醪中主要微生物是耐鹽乳酸菌。發酵溫度越高，醬醪中乳酸菌代謝越活躍，進而產生大量乳酸，從而引起醬汁pH 值降低[15]。發酵中后期，3 組醬汁的pH 值減少幅度變緩這是因為醬醪加入酵母菌后，酵母菌和乳酸菌發生激烈競爭，乳酸菌發酵受到抑制，酵母菌發酵產生乙醇，醬汁的總酸和pH 值趨于穩定[16]。

2.2.3 醬汁還原糖變化

醬汁中的還原糖不僅是微生物的代謝底物，也是美拉德反應的底物，直接影響醬油的風味和色澤。還原糖能夠通過美拉德反應、焦糖化反應影響醬油色澤，淀粉質原料經淀粉酶分解生成的葡萄糖、果糖、阿拉伯糖也是醬油甜味的主要成分。同時還原糖指標的變化還能反映出酵母菌的代謝活力。3 組樣品中還原糖含量的變化結果見圖5。

從圖5 可以看出，3 組曲線均呈先升高后降低，最終趨于平穩的趨勢，這是因為發酵初期的原料中淀粉被大量分解，使還原糖快速累積[17]；隨著酵母菌液的加入，酵母菌開始大量增殖、代謝，還原糖被不斷消耗；后期各種微生物活動均減弱，還原糖含量變化不大。通過3 組對比發現，發酵前期，還原糖含量增長幅度：高溫釀造組＞常溫釀造組＞低溫釀造組。這是因為溫度越高，淀粉酶活力越高，能夠消化產生更多的還原糖；發酵中期，在酵母菌的分解下，3 組還原糖含量均降低至相當水平；發酵后期，低溫發酵組還原糖含量有小幅度降低，推測是由于美拉德反應消耗了少量還原糖。

2.2.4 醬汁中氨基酸態氮變化

氨基酸態氮在很大程度上決定了醬油的鮮味[18]，也是醬油分級的重要指標。大豆中的蛋白質被堿性蛋白酶和中性蛋白酶分解成肽，谷氨酰胺酶可將原料中的谷氨酰胺轉化為谷氨酸，提高醬油的鮮味[19]，構成了醬油的特殊口味。醬汁中氨基酸態氮的含量結果見圖6。

從圖6 可以看出，醬汁中的氨基酸態氮含量均出現前期急速升高，后期較穩定的規律。在發酵前期，3組氨基酸態氮含量增長幅度為高溫釀造組＞常溫釀造組＞低溫釀造組，這是因為在高溫作用下，非酶解的氨基酸和肽溶出多，造成初期氨基酸態氮含量急速升高。發酵中期，低溫釀造組保持較快增長。這是因為低溫有利于酶活力的保存，蛋白酶的作用時間延長[20]，在發酵中期依然能夠分解蛋白原料。發酵后期，氨基酸態氮只有小幅度波動。

2.2.5 醬汁中全氮的變化

全氮包括蛋白質、胨、肽類、氨基酸等可溶性含氮物質。全氮含量是高鹽稀態醬油重要的分級指標，也是醬油發酵成熟與否、發酵品質高低的重要衡量指標。醬汁中全氮的含量結果見圖7。

圖7 不同發酵工藝全氮變化Fig.7 Total nitrogen content changes in different brewing techniques

從圖7 可以看出，3 組全氮指標均出現前期升高，中后期小范圍波動的規律。發酵前期，高溫釀造組全氮峰值最高，中后期變化不大，出現了小幅度波動。低溫釀造組全氮指標在前、中期持續升高，常溫釀造組處于中間值。

2.3 原油的理化指標

3 組醬醪經壓榨、超高溫消毒法滅菌（ultra high temperature treated，UHT）、終沉淀后，獲得原油，取樣測定理化指標，結果見表2。

表2 原油理化指標對比Table 2 Comparison of physicochemical indicators of crude oil

從表2 可以看出，低溫釀造組氨基酸態氮、全氮含量最高，其次是常溫釀造組，高溫釀造組品質最低。證明低溫釀造工藝下，蛋白質的消化率最高，蛋白酶的作用發揮更充分；高溫釀造組醬油的可溶性無鹽固形物含量最高，這是因為發酵初期的高溫使得曲料中的物質溶出更充分；低溫釀造組醬油色值最淺，其次是常溫釀造組，高溫釀造組醬油顏色最深，這與美拉德反應的強弱直接相關。

2.4 原油的感官分析

將壓榨、UHT 滅菌、沉淀后的原油，進行品評試驗。品評結果見圖8。

圖8 感官評價結果Fig.8 Results of sensory evaluation

從圖8 可以看出，低溫釀造組在色澤、香氣、滋味、體態4 個維度均獲得最高分，常溫釀造組處于中間位置，高溫釀造組原油得分最低。

3 結論

本研究發現經過品評，低溫釀造組原油品質高，酯香、醇香濃郁，適合蘸食等高品質產品，但同時耗能較大，實際生產中為了取得充分后熟風味，需要延長發酵時間；常溫釀造組能耗小，原油各項指標較均衡，適用于常規類產品；高溫釀造組可溶性無鹽固形物含量高，原油顏色較深，適合老抽、紅燒類產品。同時由于高溫發酵條件下，各項理化指標均在前期就達到峰值，因此可適當縮短發酵周期。今后可以針對醬油產品的特性要求和周轉情況，選取適合的發酵工藝。