雪蓮菌富硒條件優化及體外抗氧化活性分析

陳珂，韓瑋鈺，袁亞宏，岳田利*

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安 710069）

雪蓮菌（Tibetan kefir grains，TKGs），又稱藏靈菇，是一種天然混菌發酵系統，通過大自然長期馴化，逐步形成由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多種微生物組成的穩定共生的群落，其作為傳統發酵劑在青海和西藏等地已有幾百年的食用歷史[1]。雪蓮菌生長形狀無規律且不規則，多數呈球狀或米粒狀，逐漸生長為花椰菜狀，顆粒直徑大小從10 mm 到40 mm 不等，顏色從白色到淺黃色，由大約86%的水分和14%的干物質組成，干物質包括多糖、蛋白質、脂肪和灰分，其來源不同成分含量可能有所不同[2-5]。雪蓮菌的質地具有一定的彈性和黏稠感，其黏稠感來源于胞外多糖、脂質和蛋白質組成的天然凝膠基質結構[2]。這種凝膠基質結構由雪蓮菌中的乳酸菌產生，乳酸菌可以分泌表層蛋白和由葡萄糖、半乳糖通過糖苷鍵連接的胞外多糖——開菲爾多糖[6]。雪蓮菌化學成分十分復雜，具有多種功能活性成分[7]，其發酵乳也具有多種功能活性，如調節腸道菌群、抗氧化、抑制有害菌群生長等[8]。

硒（Se）是人體必需的微量元素之一，其存在形式主要分為無機硒和有機硒[9]。在自然界中，無機硒包括硒酸鹽和亞硒酸鹽，有機硒以硒氨基酸和硒蛋白為主[10]。硒具有多種重要的生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力和調節腸道菌群等[11-12]。機體主要是通過食物攝取硒元素[13]。飲食硒攝入不足可能會導致硒缺乏癥，從而引起克山病、大骨節病等[14]。因此，通過膳食合理地補充硒元素成為目前的研究熱點，而微生物富硒因其時間短、效率高、安全可控等特點受到廣泛關注。

大量研究證明，微生物可以將無機硒生物轉化為有機硒或納米硒[15]，相較于無機硒，有機硒和納米硒的生物利用率更高[16]。因此，富硒微生物具有更高效地為機體補充硒元素的潛力。多種益生菌都可以吸收和轉化無機硒，如酵母菌、乳酸菌和雙歧桿菌等[17-19]。雪蓮菌作為一種復雜的混菌基質，主要有乳酸菌、酵母菌和醋酸菌，同時含多種益生菌[20]。基于此特點，雪蓮菌可能具有較好的吸收和轉化硒的潛力。本文通過雪蓮菌富硒條件的優化，確定最佳的富硒時間、富硒溫度、富硒方式和培養條件等，將雪蓮菌與硒有機結合，制備出具有較高生物功能活性的富硒雪蓮菌，為雪蓮菌的創新型應用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪蓮菌：本試驗所用菌種來自西藏拉薩農戶家中。亞硒酸鈉（分析純）：上海國藥化學試劑有限公司；純牛奶：內蒙古蒙牛乳業股份有限公司；濃硝酸、濃鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硼氫化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈉、K3[Fe（CN）6]、氨基水楊酸、無水乙醇（均為分析純）：西隴科學股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）試劑、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]試劑：北京Solarbio 科技公司。

微波消解儀（Multiwave PRO）：奧地利Anton Paar Gmbh 公司；液相-原子熒光光度計（LC-AFS-8530）：北京海光儀器有限公司；多功能酶標儀（VictorX3）：美國PE 公司；真空冷凍干燥機（FD5-3）：金西盟科技有限公司；電熱石墨消解儀（BHW-09A45）：上海博通化學科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

參考文獻[21]將雪蓮菌菌種活化培養。雪蓮菌在4 ℃無菌牛奶中保藏。菌種活化時，將保藏的菌種通過篩網濾出，無菌純水洗滌數次，并接種至無菌純牛奶中，于28 ℃恒溫靜置培養24 h。

1.2.2 總硒含量測定

將所測樣品預凍后進行真空冷凍干燥，完成后記錄樣品質量，將樣品置于消解罐中，加入5 mL 濃硝酸，120 ℃預消解40 min。結束后向消解罐中加入1 mL濃硝酸和1 mL 體積分數30%過氧化氫，并將消解罐放入微波消解儀中，設置程序為120 ℃保持1 min，150 ℃保持5 min，180 ℃保持10 min，最后冷卻至60 ℃保持20 min。結束后將消解罐打開泄壓，移至電熱石墨消解儀中160 ℃趕酸1 h 至消解罐中保留1 mL的液體，冷卻后向消解罐中加入5 mL 體積分數為50%鹽酸進行還原，110 ℃還原30 min。將消解罐內液體倒入50 mL 容量瓶中，用體積分數為40%鹽酸溶液定容至50 mL，必要的進行稀釋測量。根據標準曲線計算樣品的總硒含量（Z，μg/g）。

式中：C1為樣品消解定容稀釋后的溶液濃度，μg/L；T 為樣品測量前的稀釋倍數；V 為樣品消解后的定容體積，mL；M1為樣品富硒后生物量，g。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 富硒率的測定

根據標準曲線計算出樣品的總硒含量，再根據富硒過程中加入的總硒含量計算富硒率（X，%）。

式中：C1為樣品消解定容稀釋后的溶液濃度，μg/L；T 為樣品測量前的稀釋倍數；V 為樣品消解后的定容體積，mL；S1為富硒培養基中加入的無機硒量，μg。

1.2.3.2 生物量及生物量增長率的測定

將培養結束后的富硒雪蓮菌從培養基中濾出，收集菌體并用無菌純水洗滌數次，于-20 ℃預凍3 h，然后進行真空冷凍干燥，結束后立即進行稱量并記錄質量，生物增長率（S，%）計算公式如下。

式中：M1為樣品富硒后生物量，g；M2為樣品富硒前生物量，g。

1.2.3.3 無機硒含量的測定

向待測樣品中加入8 mL 50%鹽酸，通過600 W 功率進行超聲45 min，超聲結束后將樣品放入沸水中，沸水浴30 min。然后通過8 000 r/min 離心30 min。離心結束取上清液，取上清液1 mL 進行總硒含量測定，根據稀釋倍數和總硒含量標曲計算樣品無機硒含量。

1.2.3.4 有機硒含量的計算

樣品有機硒含量（Y，μg）和有機硒占比（B，%）計算公式如下。

式中：S1為樣品總硒總量，μg；S2為樣品無機硒含量，μg。

1.2.4 菌體透析

菌體透析用于除去富硒雪蓮菌菌體表面附著的無機硒。將0.1 g 菌體與10 mL 的無菌純水混合，置于分子量為100 Da 的透析袋中。將透析樣品放入無菌純水中靜置透析，每2 h 換一次透析外液，透析48 h 后收集透析袋中的液體和菌體。將液體與菌體于-80 ℃預凍過夜，然后真空冷凍干燥后用于下一步試驗或測量。

1.2.5 富硒條件優化

1.2.5.1 富硒溫度、富硒時間、亞硒酸鈉添加時間

設定富硒溫度為20、25、28、30、35、37 ℃下富硒24 h，接種量為1%，培養基中的亞硒酸鈉質量濃度為15 μg/mL，培養基體積為15 mL，考察不同富硒溫度對富硒雪蓮菌總硒含量的影響。

設定富硒時間為6、12、24、36、48 h，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養基中的亞硒酸鈉質量濃度為15 μg/mL，培養基體積為60 mL。考察不同富硒時間對富硒雪蓮菌總硒含量的影響。

設定亞硒酸鈉添加時間為雪蓮菌接種后、3、6、9、12 h，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養基中亞硒酸鈉質量濃度為45 μg/mL，培養基體積為60 mL。考察不同亞硒酸鈉添加時間對富硒雪蓮菌總硒含量的影響。

1.2.5.2 培養方式和富硒方式

分為靜置培養和160 r/min 搖床培養，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養基中亞硒酸鈉質量濃度為45 μg/mL，亞硒酸鈉添加時間為3 h，培養基體積為60 mL。考察不同培養方式對富硒雪蓮菌總硒含量、富硒率、生物量及有機硒占比的影響。

設定富硒方式分為馴化和非馴化，富硒溫度為28℃，接種量為1%，培養基中亞硒酸鈉質量濃度為45 μg/mL，亞硒酸鈉添加時間為3 h，培養基體積為60 mL。馴化過程為梯度富硒馴化，即3 μg/mL 富硒24 h、6 μg/mL富硒24 h、9 μg/mL 富硒24 h、12 μg/mL 富硒24 h、15 μg/mL 富硒24 h。非馴化過程為菌體在45 μg/mL富硒24 h。

1.2.5.3 富硒底物濃度

初步設定富硒底物濃度為15、30、45、60、75 μg/mL，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養基體積為60 mL。考察不同富硒底物濃度對富硒雪蓮菌生物量、總硒含量及透析后總硒含量占比的影響。

馴化過程中設定馴化富硒質量濃度分為兩種梯度，第一種梯度為3、6、9、12、15 μg/mL；第二種梯度為9、18、27、36、45 μg/mL。富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養基中亞硒酸鈉質量濃度為45 μg/mL，亞硒酸鈉添加時間為雪蓮菌接種后3 h，培養基體積為60 mL。考察馴化過程中不同富硒底物濃度對富硒雪蓮菌總硒含量、富硒率、生物量及有機硒占比的影響。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 樣品前處理方式

取雪蓮菌和富硒雪蓮菌各0.5 g，向其中加入5 mL蒸餾水，將菌體渦旋10 min，再通過過濾收集液體，獲得菌懸液。

1.2.6.2 DPPH 自由基清除率測定

DPPH 自由基清除率測定方法參考文獻[22]并稍作修改。試驗所用DPPH 溶液的濃度為0.1 mol/L，用無水乙醇溶解。每0.1 mL 樣品與0.9 mL DPPH 溶液混合，在室溫下放置在黑暗中60 min，然后使用酶標儀在517 nm 處測量其吸光度。根據吸光度計算DPPH 自由基清除率（X1，%），計算公式如下。

式中：A1為樣品與DPPH 溶液反應后吸光度；A2為無水乙醇與DPPH 溶液混合后吸光度；A3為樣品與無水乙醇混合后吸光度。

1.2.6.3 ABTS＋自由基清除率測定

根據文獻[23]的方法稍加修改。將7 mm ABTS 水溶液與2.45 mmol/L K2S2O8等體積混合，室溫靜置12 h。12 h 后，用蒸餾水將ABTS 溶液稀釋至734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將0.1 mL 不同濃度的樣品溶液和0.9 mL ABTS 溶液混合。在室溫黑暗條件下反應30 min后，于732 nm 處測量吸光度。ABTS＋自由基清除率（X2，%）計算公式如下。

式中：A1為樣品與ABTS 溶液反應后吸光度；A2為蒸餾水與ABTS 溶液混合后吸光度；A3為樣品與蒸餾水混合后吸光度。

1.2.6.4 羥自由基清除率測定

按照文獻[24]的方法改進后進行測定。取2 mL 樣品與1 mL 9 mmol/L FeSO4和2 mL 8.8 mmol/L H2O2均勻混合，放置10 min 后加入2 mL 9 mmol/L 水楊酸溶液，于37 ℃反應30 min，測510 nm 吸光度。羥自由基清除率（X3，%）計算公式如下。

式中：A1為樣品反應后吸光度；A2為蒸餾水代替樣品混合后吸光度；A3為樣品與蒸餾水代替H2O2混合后吸光度。

1.3 數據分析

數據采用Microsoft Excel 軟件進行統計，方差分析和顯著性分析采用SPSS 18.0，結果以平均值±標準差表示，采用Duncan's 檢驗和獨立樣本T 檢驗計算統計學差異的顯著性，P＜0.05 為顯著。

2 結果與討論

2.1 總硒含量的測定

使用原子熒光光譜法測量硒標準溶液的總硒含量，擬合建立硒標準曲線，如圖1 所示。

由圖1 可知，硒標準溶液樣品硒濃度保持在0～20 μg/L 范圍內。回歸方程R2達到0.999 8，說明儀器所測量的硒濃度和熒光強度的線性關系較好，在此線性關系范圍內，可用于樣品總硒含量的測定。

2.2 富硒溫度、富硒時間和亞硒酸鈉添加時間的確定

富硒溫度、富硒時間和亞硒酸鈉添加時間對總硒含量的影響見圖2。

圖2 富硒溫度、富硒時間和亞硒酸鈉添加時間對總硒含量的影響Fig.2 Effects of temperature，time and sodium selenite addition time on total selenium content

由圖2A 可知，隨富硒溫度的升高，富硒雪蓮菌的總硒含量呈現先上升后下降的趨勢。在28 ℃時總硒含量顯著高于其他溫度。這可能與雪蓮菌中微生物的活性有關，當微生物處于適宜生存環境中，其活力較高，因此對硒轉化的效率最高，從而使得富硒雪蓮菌總硒含量較高，28 ℃即為雪蓮菌的最適生存溫度，當富硒溫度低于或高于28 ℃時，微生物活性較低，從而出現了隨著富硒溫度升高，富硒雪蓮菌的總硒含量先上升后下降的現象。在富硒過程中，富硒時間的把控至關重要。由圖2B 可知，隨著富硒時間的延長，富硒雪蓮菌的總硒含量呈現逐漸上升后趨于穩定的趨勢。富硒時間達到24 h 后，總硒含量并無顯著上升趨勢。這說明在整個富硒過程中，雪蓮菌在對培養基中的無機硒進行吸收與轉化，靜置培養使得雪蓮菌只接觸到底層培養基，在富硒24 h 時，雪蓮菌已對其周圍培養基中的無機硒進行充分地吸收與轉化。研究表明，亞硒酸鈉添加時間對菌體富硒效果有一定的影響[25]。如圖2C所示，在雪蓮菌接種后3 h 時，添加亞硒酸鈉的富硒效果最好，樣品總硒含量顯著高于其他時間點。這可能是因為此時雪蓮菌內部的菌群正處于活性最佳狀態，對培養基內環境的改變比較敏感，能積極吸收和轉化無機硒。因此，選擇富硒溫度為28 ℃，在接種后3 h 添加亞硒酸鈉并富硒24 h 進行后續試驗。

2.3 富硒底物濃度優化結果

培養基中亞硒酸鈉的濃度會極大影響富硒雪蓮菌的總硒含量。底物濃度對總硒含量、透析后總硒含量占比和生物量的影響見圖3。

圖3 富硒底物濃度對總硒含量、透析后總硒含量和生物量的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on the total selenium content，the total selenium content after dialysis，and biomass

由圖3A 可知，培養基中亞硒酸鈉的濃度越高，富硒雪蓮菌的總硒含量越高，可見雪蓮菌對亞硒酸鈉有很強的吸收和吸附能力。通過將富硒樣品進行透析，將樣品表面吸附的無機硒除去，發現透析后樣品的總硒含量占原樣品的總硒含量的比例隨富硒底物濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢。這可能是雪蓮菌菌體自身結構導致。富硒底物濃度太高時，雪蓮菌將大量無機硒吸附在菌體表面，而并非吸收進菌體內部。雪蓮菌是多糖-脂質-蛋白質組成的一種具有黏彈性的基質，微生物則嵌在基質表面或內部。而一些生物大分子，即多糖、脂質和蛋白質可以吸附和包裹無機硒和硒納米顆粒[26]。當雪蓮菌接觸到無機硒時，多糖-脂質-蛋白質基質首先充分包裹和結合無機硒，再由微生物進行轉化。因此，亞硒酸鈉濃度較低時，無法使微生物充分吸收和接觸無機硒，從而限制其發揮轉化的作用；而隨著富硒底物濃度的升高，在富硒底物濃度為45 μg/mL 時，微生物充分發揮其吸收和轉化有機硒的作用；當富硒濃度再升高，雪蓮菌更多是吸附無機硒，也可能將無機硒轉化為單質硒而不是有機硒。

由圖3B 可知，隨著富硒底物濃度的增加，富硒雪蓮菌的生物量呈先升高后下降的趨勢。富硒濃度升高過程中，促進了雪蓮菌的生長，而在濃度過高時，則抑制雪蓮菌的生長。為確保富硒雪蓮菌的具有較高有機硒含量和菌活性，選擇富硒底物濃度為45 μg/mL。

2.4 富硒培養方式的確定

在傳統制作工藝中，雪蓮菌發酵一直通過靜置發酵進行培養，微生物無法充分與培養基進行接觸，菌活性會受限。因此本研究對比靜置發酵與搖床培養對總硒含量、富硒率、生物量和有機硒占比的影響，結果見表1。

表1 培養方式對總硒含量、富硒率、生物量和有機硒占比的影響Table 1 Effects of culture method on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage

由表1 可知，搖床富硒的樣品總硒含量和富硒率顯著較高。通過搖床培養，菌體得以充分接觸培養基，使得生物量顯著高于靜置培養條件下的富硒雪蓮菌。而培養方式對富硒樣品中有機硒占比沒有影響，還需要通過其他優化方式改善。

2.5 富硒方式的確定

有研究表明，定向馴化富硒可以提升硒耐受能力和富硒能力，提高有機硒含量[27]。為提升富硒雪蓮菌的有機硒含量，本研究通過梯度馴化雪蓮菌富硒，富硒方式對總硒含量、富硒率、生物量和有機硒占比的影響見表2。

表2 富硒方式對總硒含量、富硒率、生物量和有機硒占比的影響Table 2 Effects of selenium enrichment methods on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage

由表2 可知，富硒馴化使雪蓮菌的生物量、富硒率和有機硒占比得到了極顯著的提高，由于其生物量的顯著提高，根據其生物量所得的總硒含量則會有一定程度的下降。結果表明，馴化富硒是一種有效提高菌體對硒耐受能力、富硒能力和硒轉化效率的方法，此方法可以讓雪蓮菌慢慢接受含硒培養基的生存環境，并主動吸收和轉化無機硒，顯著提升富硒雪蓮菌有機硒占比。

2.6 馴化過程中富硒底物濃度的確定

馴化過程中富硒底物濃度對總硒含量、富硒率、生物量和有機硒占比的影響見表3。

表3 馴化過程中富硒底物濃度對總硒含量、富硒率、生物量和有機硒占比的影響Table 3 Effects of substrate concentration during domestication on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage

由表3 可知，提高富硒馴化濃度梯度對其生物量的增長產生了抑制效果，其富硒率和有機硒占比都顯著降低。試驗結果表明，高濃度梯度中，18 μg/mL 的富硒濃度時菌體就出現了紅色，而在低濃度梯度中并未出現紅色。以上結果可知，提高富硒馴化濃度梯度，會抑制整體富硒效果，高濃度梯度富硒不僅會抑制菌體生長，降低富硒率，還會使菌體產生大量單質硒，使有機硒占比顯著降低。因此確定富硒馴化濃度底物為3、6、9、12、15 μg/mL。

2.7 富硒雪蓮菌優化后的基本參數

通過富硒條件優化，確定富硒雪蓮菌制備的條件：富硒溫度為28 ℃、富硒時間為24 h、亞硒酸鈉添加時間為雪蓮菌接種后3 h，通過160 r/min 搖床培養，以3、6 、9、12、15 μg/mL 梯度馴化富硒。由此得到的富硒雪蓮菌的基本參數，見表4。

表4 富硒雪蓮菌基本參數Table 4 Basic parameters of selenium-enriched Tibetan kefir grains

2.8 抗氧化能力分析

硒和雪蓮菌均具有一定的抗氧化活性[28-29]，富硒雪蓮菌的抗氧化能力測定結果見圖4。

圖4 抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity

如圖4 所示，富硒雪蓮菌的抗氧化活性顯著高于雪蓮菌。富硒后的雪蓮菌抗氧化活性較高可能是菌體本身的抗氧化活性與硒結合的結果。經過微生物將硒進行生物轉化后，有機形式的硒的抗氧化活性更高[30]。

3 結論

本試驗通過雪蓮菌對無機硒進行吸收和轉化，最終確定了富硒條件為富硒溫度為28 ℃，富硒時間為24 h，亞硒酸鈉添加時間為雪蓮菌接種后3 h，通過160 r/min搖床培養，以3、6、9、12、15 μg/mL 梯度馴化富硒。富硒雪蓮菌的菌活性、富硒率、有機硒增長比提高。優化后的富硒雪蓮菌，總硒含量為（2 194.41±58.49）μg/g，生物量增長率為（262.22±34.59）%，富硒率（35.47±0.78）%，有機硒占比（84.57±1.45）%。同時富硒雪蓮菌的抗氧化活性顯著高于雪蓮菌，達到了硒和雪蓮菌有機結合的效果。制備所得的富硒雪蓮菌具有更高的抗氧化活性，可進一步提升雪蓮菌的開發利用價值，對擴展雪蓮菌的實際應用和創新研究具有重要意義。