超聲波輔助酶法提取油茶粕蛋白工藝優化及其功能活性

朱靜，呂靜，陳龍，陳亞藍

（信陽農林學院，河南 信陽 464000）

油茶（Camellia oleifera Abel）別名茶子樹，具有種植歷史悠久、分布廣泛、栽培面積大、用途廣泛等特性[1]。我國是世界上主要油茶產品生產地之一，主要集中在河南、浙江、江西、湖南、江西等地，到2025 年，全國年產量預計可達200 萬t，隨之產生的廢棄物也數量巨大，其中油茶籽粕（Camellia oleifera seed-cake，COS）由30%～60%多糖、10%～20%蛋白質、0.5%～7.0%粗脂肪、12%～18%茶皂素和15%～25%粗纖維等成分組成，具有很高的利用價值[2]，但目前對于油茶副產物的綜合利用相對匱乏，只有少量COS 用于燃料、肥料和飼料，造成了一定的資源浪費。

COS 所含蛋白質按照Osborne 分類法主要包括清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白以及谷蛋白，其中的清蛋白、醇溶性蛋白以及谷蛋白具有較強的抗氧化活性[3]。COS 含有大量人體必需氨基酸，為潛在的優質植物蛋白資源[4]。研究表明，油茶籽粕粗蛋白（Camellia oleifera seed-cake crude protein，COCP）及其水解物還具有降血壓、降血脂、抗氧化等功能特點。李婷婷等[5]發現油茶籽糖蛋白能顯著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基，具有一定的抗氧化能力。李慧珍等[3]從油茶餅粕中分離純化蛋白質得到分離蛋白組分，發現其具有一定的抗氧化活性及金屬離子螯合能力。龔吉軍等[6]通過動物實驗發現，油茶籽粕多肽能夠顯著降低高血脂模型大鼠血清中總膽固醇與甘油三酯的含量、動脈硬化指數，還能有效提高高密度脂蛋白膽固醇的水平，結果表明油茶粕多肽具有良好的降血脂功效。目前COCP 的提取方法主要有堿溶酸沉法、酶法、超聲波輔助提取法。其中最常用的方法是堿溶酸沉法，這種方法具有操作簡單、成本低等特點，較為適合工業化生產，但蛋白質的提取率較低[7]；酶法是對油茶粕蛋白進行適當的酶解預處理，去除與蛋白結合或反應的糖類物質、提高油茶粕蛋白的提取率，但是消耗時間久[8]；超聲波輔助提取法是利用超聲波作用粉碎植物細胞，釋放內容物，能夠解決水溶法提取時間長、效率低等問題[9]。安宇等[10]研究發現超聲波處理對蕓豆蛋白質的抗氧化能力有顯著性影響。

本文采用超聲波輔助酶解的方法提取COCP，并初步探究該法所得的醇溶性粗蛋白對羥自由基、DPPH自由基、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2' -azino -bis -（3 -ethylbenzothiazoline -6 -sulfonic acid），ABTS] 陽離子自由基的清除能力以及其降脂特性，以期為COCP 的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

油茶籽粕：信陽崧潤茶油有限公司；低溫α-淀粉酶（50 U/mg）、纖維素酶（≥400 U/mg）、膽固醇酯酶（150 U/mg）、胰脂肪酶（3 萬U/g）、考來烯胺：上海源葉生物科技有限公司；石油醚、95%乙醇、鹽酸：鄭州派尼化學試劑廠。所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

超聲波細胞破碎儀（Scientz-IID）：寧波新芝生物科技有限公司；冷凍干燥機（FD-1A-80）：上海比朗儀器制造有限公司；凱氏定氮儀（ST-04）：山東盛泰儀器有限公司；紫外分光光度計（A390）：翱藝儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-0-2）：北京市永光明醫療儀器有限公司；低速離心機（TDL-40B）：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

油茶籽粕蛋白提取工藝流程圖見圖1。

圖1 COCP 提取工藝流程圖Fig.1 COCP extraction process flow

1.3.1 酶處理單因素試驗

參考張新昌等[8]的方法，對COS 進行干燥粉碎，采用石油醚脫脂、乙醇脫皂后得到試驗原料。以酶解時間60 min、酶解溫度50 ℃、每100 g 原料添加1.0%淀粉酶與0.3%纖維素酶、酶解pH4.5 為固定條件，考察酶解時間（30、60、90、120、150 min）、酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）、淀粉酶與纖維素酶添加量（0.5%和0.1%、1.0%和0.3%、1.5%和0.5%、2.0%和0.7%、2.5%和0.9%）、酶解pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對COCP回收率的影響。

1.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶添加量（C）、酶解pH 值（D）進行L9（34）正交試驗，優化UEAE 法提取蛋白的工藝條件，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗設計Table 1 Design for orthogonal test

1.3.3 超聲處理單因素試驗

參照范東斌等[9]的方法，取100 g 酶預處理后的原料粉末，添加70%乙醇，料液比1∶40（g/mL），超聲波功率（250、300、350、400、450 W），超聲時間（20、40、60、80、100 min），將濾渣進行3 次浸提后，合并濾液并靜置過夜，再過濾1 遍后進行酸沉，將沉淀物冷凍干燥，即可得到COCP。

1.3.4 COCP 回收率

COCP 回收率（S，%）計算公式如下。

式中：m 為所得COCP 質量，g；M 為COS 中粗蛋白含量，g

依據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法，檢測得出本文所采用的油茶餅粕的粗蛋白含量為16.8%。

1.3.5 COCP 抗氧化能力測定

1.3.5.1 羥自由基（·OH）清除能力測定

參照胡平平[11]的方法，測定COCP 對羥自由基的清除能力，羥自由基清除率（X1，%）計算公式如下。

式中：A0為空白組吸光值；A1為無雙氧水對照組吸光值；A2為試驗組吸光值。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力測定

根據祝子坪等[12]的方法，準確配制濃度為50 mg/mL的COCP 溶液及50 mg/mL 的維生素C 溶液，分別進行DPPH 自由基清除試驗。DPPH 自由基清除率（X2，%）計算公式如下。

式中：A0為空白組吸光值；A1為試驗組吸光值；A2為無水乙醇對照組吸光值。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除能力測定

根據馬雅鴿等[13]的方法，ABTS+自由基清除率（X3，%）計算公式如下。

式中：A1為樣品吸光值；A0為空白對照吸光值。

1.3.6 COCP 降脂功能測定

1.3.6.1 膽酸鈉結合能力測定

參照張煜[14]的研究方法，略作修改。分別吸取10、20、30、40、50 μL 的0.05 mg/mL COCP 溶液于25 mL 具塞試管中，向其中加入磷酸鹽緩沖溶液6 mL，然后加入4 mL 由磷酸鹽緩沖液配制成的0.6 mmol/L 甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉溶液，在37 ℃條件下振蕩2 h 后，4 000 r/min 離心20 min，然后收集上清液。取2.5 mL 上清液，加入7.5mL 的60%硫酸溶液；在70 ℃水浴20 min，取出之后立即冰浴5 min，在387 nm 測定其吸光值。膽酸鹽吸附試驗以考來烯胺作為陽性對照。

1.3.6.2 胰脂肪酶抑制率測定

根據段振[15]和蘇建輝[16]的方法，胰脂肪酶抑制率（Y1，%）計算公式如下。

式中：A 為空白管消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；B 為空白對照管消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；C 為樣品管消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；D 為背景對照管消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL。

1.3.6.3 膽固醇酯酶抑制率測定

參考文獻[16]的方法測定膽固醇酯酶抑制率。底物4-硝基苯基丁酸酯用乙腈預先溶解配制，并進行冷凍保存。COCP 及膽固醇酯酶提前用高純水進行溶解，加入4-硝基苯丁酸酯液，其反應在pH7.0 磷酸鹽緩沖液中進行。25 ℃恒溫反應5 min，然后靜置3 min 于405 nm 處測定其吸光值。配制方法見表2。

表2 膽固醇酯酶活性抑制體系Table 2 Inhibition system of cholesterol esterase activity

膽固醇酯酶抑制率（Y2，%）計算公式如下。

式中：A0為空白管吸光值；A1為空白對照管吸光值；A2為背景對照管吸光值；A3為抑制劑管吸光值。

1.4 數據分析

所有數據采用office 2010 軟件進行作圖分析，SPSS 21.0 軟件進行ANOVA 分析。

2 結果與分析

2.1 酶解條件單因素對COCP 回收率的影響

不同酶解條件對COCP 回收率的影響見圖2。

圖2 酶解條件對COCP 回收率的影響Fig.2 Effect of enzymatic conditions on COCP recovery rate

由圖2A 可知，隨著酶解時間的延長，COCP 回收率隨之增加。在酶解時間為150 min 時，COCP 回收率達到最高，為（74.1±1.3）%。當酶解時間為120 min 時，COCP 的回收率為（72.5±1.4）%，與酶解時間為150 min 時的回收率無顯著性差異。為了節約能源以及縮短生產周期等，選擇酶解時間90、120、150 min 進行正交試驗。

由圖2B 可知，隨著酶解溫度的升高，COCP 回收率呈先上升后下降趨勢，在45～50 ℃時，COCP 回收率隨著酶解溫度的升高而升高，當酶解溫度為50 ℃時，COCP 回收率為最高，達到（74.2±1.4）%。但是隨著酶解溫度的繼續升高，酶在高溫條件下，部分酶變性失活，活性逐漸降低[8]，隨之COCP 的回收率也逐漸降低。由此可以看出，COS 酶預處理過程中溫度的控制尤為關鍵，選擇酶解溫度45、50、55 ℃進行正交試驗。

由圖2C 可知，在淀粉酶和纖維素酶添加量分別為0.5%和0.1%時，COCP 的回收率為（63.4±1.3）%，隨著酶添加量的增加，COCP 回收率明顯上升；在淀粉酶和纖維素酶添加量為2.0%和0.7%時，COCP 回收率較高，為（76.8±1.0）%，繼續增加酶添加量，回收率增幅不顯著。綜合考慮，選擇淀粉酶與纖維素酶添加量為1.5%和0.5%、2.0%和0.7%、2.5%和0.9%進行正交試驗。

由圖2D 可知，COCP 回收率為先上升后下降趨勢。在酶解pH4.5 時，COCP 回收率達到最大值，為（77.9±1.3）%。在pH 值大于4.5 時，隨著pH 值的逐漸增加，酶的活性也逐漸減小（已報道淀粉酶最適pH4.5，纖維素酶最適pH4.0～5.0），導致COCP 回收率逐漸降低，因此選擇酶解pH 值為4.0、4.5、5.0 進行正交試驗。

2.2 酶解條件正交試驗結果分析

在單因素試驗基礎上得到了各因素的最適工藝參數，以COCP 回收率為指標，設計四因素三水平正交試驗，正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 L（934）正交試驗設計統計分析Table 3 Statistics of L（934）orthogonal test design

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

由表3 和表4 可知，4 個因素對COCP 回收率均有極顯著影響（p＜0.01）。4 個因素對COCP 回收率的影響順序依次為C＞A＞D＞B。提取條件最優組合為A3B2C3D2，即在酶添加量2.5%和0.9%、酶解時間150 min、酶解pH4.5、酶解溫度50 ℃的條件下，COCP 的回收率最高。通過驗證試驗，得到該條件下COCP 的回收率為（79.0±1.7）%，證明所優化的結果是可行的。

2.3 超聲條件對COCP 回收率的影響

不同超聲條件對COCP 回收率的影響見圖3。

圖3 超聲條件對COCP 回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasound conditions on COCP recovery rate

由圖3A 可知，隨著超聲時間的不斷延長，COCP回收率也隨之增長。這是因為超聲時間的延長，會使非均相體系混合更加均勻，有利于蛋白的溶出[17-19]。在超聲時間為60 min 時，COCP 回收率為（80.9±1.4）%，超聲時間繼續延長，COCP 的回收率無顯著提高（p＞0.05）。為提高生產以及節約能源，超聲時間60 min 時為最佳。

由圖3B 可知，回收率呈現先上升后下降趨勢。在250～350 W 時，隨著超聲功率的增加，COCP 的回收率也隨之有一定的提升，當超聲功率達到350 W 時，COCP回收率達到最高值（83.3±0.6）%。這是因為超聲的空化作用在介質中產生較高的剪切力，促使細胞壁破裂，有利于蛋白質的溶出[17]。當超聲功率超過350 W 之后，隨著功率的不斷提升，COCP 的回收率隨之下降，且較大的超聲功率會產生更高的空化效應，產生強大的沖擊波和剪切力而破壞蛋白質結構，可能會導致蛋白質功能特性的喪失[18]，為了在獲得具有較好功能活性COCP 的前提下提高其回收率，因此選擇超聲功率350 W 為最佳條件。

當采用簡單的醇溶酸沉法時，COCP 回收率僅為（54.2±1.8）%，經過酶解處理和超聲處理后，回收率最高可達（83.3±0.6）%，提高了0.54 倍。

2.4 COCP 抗氧化性測定結果

自由基具有細胞毒性，能破壞細胞膜，損傷蛋白質，導致DNA 突變，修飾低密度脂蛋白，還能氧化油脂導致食品變質和營養流失[20]，對多種自由基的清除效果是判斷是否具有抗氧化性的重要指標之一。COCP抗氧化性結果見圖4。

圖4 COCP 及維生素C 抗氧化能力比較Fig.4 Antioxidant capacity comparison of COCP and vitamin C

由圖4 可知，維生素C 對羥自由基、DPPH 自由基、ABTS+自由基的清除率分別可達91.2%、95.5%、97.5%，相同濃度的COCP 的清除率分別可達66.5%、70.7%、67.9 %，相較于維生素C 的清除率略低，但仍能表明COCP 具有一定的抗氧化能力，這可能是超聲處理使其中的蛋白質暴露出更多能與自由基作用的基團[21]，尤其是疏水性氨基酸，是蛋白質具有還原性的主要原因之一[22]。何瑋[23]發現油茶粕蛋白富含17 種氨基酸，占比較高的谷氨酸及天冬氨酸能夠提高蛋白質的抗氧化性，清除多余的自由基。

2.5 COCP 降脂能力測定結果

2.5.1 COCP 與膽酸鈉的結合能力

膽酸鹽是膽汁中由膽固醇衍生而來的具有甾核結構的一類兩性大分子，可以通過對膽固醇和脂肪的消化吸收引起血脂水平升高。因此將膽酸鹽排出體外可減少膽酸鹽在肝腸循環過程中的積累，促進膽固醇的代謝，達到降血脂的目的[24]。COCP 對膽酸鹽吸附率的結果見圖5。

圖5 COCP 對膽酸鹽的吸附率Fig.5 Adsorption rate of COCP to cholate

由圖5 可知，隨著COCP 濃度的不斷提高，對膽酸鹽的吸附能力在逐步提高，在蛋白濃度為0.5 μg/mL時，對膽酸鹽吸附率達到8.1%，在濃度為2.5 μg/mL時，對膽酸鹽吸附率達到20.3%。這可能是COCP 中的疏水性氨基酸與膽酸鹽中的疏水基團結合的原因，其中疏水性越強，與膽酸鹽的結合能力就越強[25]，這說明COCP 具有一定的體外降脂能力。

2.5.2 COCP 對胰脂肪酶的抑制率

COCP 對胰脂肪酶抑制率的結果見圖6。

圖6 COCP 對胰脂肪酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of COCP on pancreatic lipase

由圖6 可知，當COCP 濃度為0.50 mg/mL 時，對胰脂肪酶的抑制率較低，當COCP 濃度為1.0 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率達到了（49.5±0.5）%，由此可以看出COCP 對胰脂肪酶有著一定的抑制率，且隨著COCP 濃度的不斷提高，對胰脂肪酶的抑制率也在不斷提高。研究發現，胰脂肪酶催化活性中心并不暴露在外，而是被疏水基團組成的表面層隱藏[26]，當胰脂肪酶與底物接觸時，通過電子分布的改變誘導胰脂肪酶三維結構改變，使活性中心暴露而出，與底物結合發生催化反應[27]。COCP 對胰脂肪酶抑制率具有一定的劑量依賴性。通過抑制胰脂肪酶活性，阻止脂肪被脂肪酶水解成游離脂肪酸和單酰基甘油酯，減少腸道對膳食中脂肪的吸收，從而促使脂肪從糞便中排出體外，達到降脂的效果[28]。

2.5.3 COCP 對膽固醇酯酶抑制率測定

COCP 對膽固醇酯酶抑制率結果見圖7。

圖7 COCP 對膽固醇酯酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of COCP on cholesterol esterase

由圖7 可知，隨著COCP 濃度的不斷提高，其對膽固醇酯酶的活性抑制作用也在相應增加，當COCP 濃度為2.5 mg/mL 時，抑制率只有2.9%，當COCP 濃度達到12.5 mg/mL 時，抑制率可以達到19.5%。膽固醇酯酶作為消化酶的一種，在水解膳食性膽固醇酯和轉運游離膽固醇到腸細胞方面起著重要作用[29]，整體呈酸性[30]，與蛋白之間的物理作用力有酸堿離子間作用力、羧基間的氫鍵作用力，COCP 對其存在一定的抑制效果，且隨劑量的增加而增加，可能是因為COCP 中含有較多的酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸。雖整體抑制率偏低，但依舊可以抑制膽固醇酯酶活性，減少個體對酯化膽固醇的吸收。

3 結論

本研究通過超聲輔助酶解工藝提取油茶籽粕粗蛋白，并對粗提物的功能活性進行初步探究。研究發現，淀粉酶和纖維素酶添加量分別為2.5%和0.9%、酶解時間150 min、酶解pH4.5、酶解溫度50 ℃，超聲功率350 W，超聲時間60 min 的條件下，粗提物的回收率最高，經過驗證可達（83.3±0.6）%，且具有一定的功能特性，對羥自由基、DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除效果，后續若對該粗提物進行分離純化水解處理，能夠進一步提高抗氧化能力。同時蛋白粗提物具有一定的膽酸鹽吸附能力和膽固醇酶抑制效果，且具有一定的劑量依賴性，對胰脂肪酶抑制方面表現較佳，蛋白粗提物濃度為1.0 mg/mL 時，胰脂肪酶抑制率可達49.5%左右。因此油茶籽粕蛋白質作為廢棄回收物，具有潛在的利用價值，后續可進一步探討超聲處理對油茶籽粕蛋白功能特性的影響，為其深加工提供理論基礎。