泥鰍肽制備及其脫色工藝優(yōu)化

毛金蓉，賀曉晴，運立媛，2*，李茜，2，張民，2，3*

（1.天津農學院 食品科學與生物工程學院，天津 300392；2. 天津農學院 農產品加工中外聯合研究中心，天津 300392；3. 天津科技大學 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457）

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）是亞洲常見的淡水魚類，主要分布于我國、日本、韓國等地[1]，因其肉質細韌、營養(yǎng)價值高、味道鮮美等特點，廣受消費者喜愛。據《中國藥典》中記載，泥鰍被稱為2 000 多年的傳統(tǒng)藥物[2]。隨著市場需求的上升，我國的泥鰍產量也逐年遞增，據《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》的報道，近年泥鰍產量以年均5.7%的速度持續(xù)增長[1]，因此泥鰍的高值化發(fā)展成為目前研究的熱點。關于泥鰍高值化產物多集中于泥鰍多糖[3]以及泥鰍凝集素[4]，相對而言，泥鰍肽制備工藝研究的報道較少。

目前，國內外關于食物源多肽的制備及研究主要分為植物源及動物源[5]，其制備方法多采用酶解法，該法反應條件溫和、易操作、安全性較高，被廣泛用于食物源多肽的制備。多肽制備量及氨基酸組成受酶解條件影響較大[6-7]，其中包括蛋白酶種類、酶解溫度、酶解時間、pH 值等條件。游麗君等[8]采用堿性蛋白酶，酶解9.42 h，獲得肽得率為36.3%的泥鰍肽；聶凌鴻等[9]采用堿性蛋白酶，酶解4 h，獲得肽得率為14.13%的泥鰍膠原蛋白肽。然而上述研究均未考慮各因素交互作用對蛋白酶酶活的影響，因此，本文在考慮蛋白酶酶活的基礎上，優(yōu)化泥鰍肽酶解工藝，以期為泥鰍肽制備提供參考。

在酶解過程中，水溶性色素也會被提取[10]，因此經過酶解得到的肽大多色澤較暗[11]，為適應市場，滿足消費者需求，需對酶解后的肽進行脫色處理。活性炭是脫色工藝中常用的脫色劑之一，因其具有吸附效果好、對樣品影響小、成本低等優(yōu)點，在香螺肽[12]、梅花鹿胎盤寡肽[13]、小麥胚芽抗氧化肽[14]等肽類物質的脫色中廣泛應用。

本研究以泥鰍為原料，經單因素試驗篩選出最適蛋白酶后，采用單因素試驗結合響應面試驗優(yōu)化酶解工藝以及脫色工藝，進而確定出適合產業(yè)化生產的酶解工藝參數以及脫色工藝參數，以期為泥鰍資源的高值化綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥鰍：市售；堿性蛋白酶（134.01 U/mg）、中性蛋白酶（39.20 U/mg）、胰蛋白酶（149.31 U/mg）、木瓜蛋白酶（136.28 U/mg）、風味蛋白酶（34.49 U/mg）、谷胱甘肽標準品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；活性炭、三氯乙酸：天津市光復精細化工研究所。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫磁力攪拌水浴鍋（HWS-28）：上海一恒科學儀器有限公司；酶聯免疫分析儀（AMR-100）：杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 泥鰍粉制備

新鮮泥鰍去頭去尾，絞為肉泥，于45 ℃烘箱干燥至恒重后粉碎，得到泥鰍粉，保存于干燥器中備用。泥鰍粉中的蛋白質含量采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定。

1.3.2 蛋白酶篩選

分別采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對泥鰍粉進行酶解試驗，其酶解條件根據各酶說明書確定相對適宜的條件（堿性蛋白酶：45 ℃，pH10.0；中性蛋白酶：50 ℃，pH6.5；風味蛋白酶：50 ℃，pH6；胰蛋白酶：37 ℃，pH8；木瓜蛋白酶：50 ℃，pH6.5），在各酶適宜的條件下，固定酶活為258 U/mL。酶解6 h 后，沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，5 000 r/min 離心20 min，取上清液，測定并對比各酶酶解上清液水解度以及肽得率。

1.3.3 泥鰍肽制備單因素試驗

結合1.3.2 篩選的蛋白酶，分別考察酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、pH 值（9.0、10.0、11.0、12.0、13.0）、酶解時間（30、60、90、120、150 min）、酶活（142、171、200、229、258 U/mL）、料液比[1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）]對肽得率的影響。本試驗先通過單因素試驗篩選出最佳酶解溫度以及pH 值后，進行后續(xù)的響應面試驗。

1.3.4 泥鰍肽制備響應面優(yōu)化試驗

根據單因素試驗結果，結合Box-Behnken 中心組合試驗設計，以酶解時間A、酶活B、料液比C 為自變量，以泥鰍肽得率Y1為響應值，建立三因素三水平試驗，優(yōu)化泥鰍肽酶解工藝。編碼和水平因素如表1 所示。

表1 制備工藝Box-Behnken 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of preparation process Box-Behnken test

1.3.5 水解度測定

采用甲醛滴定法測定酶解液水解度[15-16]。取酶解液3 mL，加入30 mL 蒸餾水，用0.05 mol/L NaOH 標準溶液滴定溶液體系至pH8.2，并維持1 min，記錄消耗NaOH 的體積，緩慢加入6 mL 中性甲醛溶液后滴加4 滴酚酞指示劑，室溫靜置5 min，繼續(xù)用0.05 mol/L NaOH標準溶液滴定溶液體系至pH9.2，并記錄消耗NaOH的體積，水解度計算公式如下。

式中：M 為水解度，%；CNaOH為滴定所用NaOH 標準液濃度，mol/L；V1為樣液滴定消耗NaOH 體積，mL；V0為空白組滴定消耗NaOH 體積，mL；0.014 為與1.00 mL 氫氧化鈉標定溶液（CNaOH=1.000 mol/L）相當的氮的質量，g；3 為所加酶解液體積，mL；V 為水解液總體積，mL；N 為樣品總含氮量，g。

1.3.6 肽得率測定

利用雙縮脲法[17]測定酶解液的肽得率。酶解液肽含量測定：取3 mL 酶解液，加入3 mL 10%三氯乙酸，混勻，靜置30 min，4 800 r/min 離心15 min，收集上清液。取4 mL 上清液于試管中，加入6 mL 雙縮脲試劑，室溫靜置10 min 后于540 nm 下測定吸光度。谷胱甘肽標準品（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）以同樣方法測定并繪制標準曲線，肽得率計算公式如下。

式中：W1為肽得率，%；m1為酶解液肽含量，mg/mL；m2為原料蛋白含量，mg；V 為水解液總體積，mL。

1.3.7 脫色劑篩選

分別探究活性炭與硅藻土兩種脫色劑的脫色效果。于50 mL 酶解上清液中添加脫色劑，添加量為1.5%，溫度50 ℃，pH6，脫色30 min 后測定肽保留率及脫色率并進行t 檢驗，根據顯著性選擇出最佳脫色劑。

1.3.8 脫色率測定

采用紫外分光光度計于190～400 nm 處對酶解液進行掃描，結果顯示酶解液最大吸收波長為320 nm，在該波長下測定脫色液吸光度，脫色率計算公式如下[18]。

式中：W2為脫色率，%；A1為脫色前樣品吸光度；A2為脫色后樣品吸光度。

1.3.9 肽保留率測定

按照1.3.6 酶解液多肽含量的測定方法測定脫色前、后的酶解液中多肽含量，并按照下列公式計算肽保留率[19]。

式中：W3為肽保留率，%；B1為脫色前樣品中多肽含量，mg/mL；B2為脫色后多肽含量，mg/mL。

1.3.10 脫色單因素試驗

結合1.3.7 篩選的最優(yōu)脫色劑，考察活性炭添加量（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）、脫色溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、脫色時間（15、30、45、60、75、90 min）對脫色率以及肽保留率的影響。

1.3.11 脫色響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，以活性炭添加量（A'）、脫色時間（B'）、脫色溫度（C'）、pH 值（D'）為影響因子，以脫色率（Y2）和肽保留率（Y3）為響應值，建立四因素三水平的試驗，優(yōu)化泥鰍酶解液脫色工藝條件，得到最佳酶解工藝組合參數。脫色工藝Box-Behnken 試驗因素與水平見表2。

表2 脫色工藝Box-Behnken 試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of decolorization process Box-Behnken test

1.4 數據處理

每組試驗重復3 次，數據分析采用Origin 2019、Design-Expert V8.0.6 及IBM SPSS Statistics 等軟件。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶篩選結果

蛋白酶對泥鰍蛋白水解度及肽得率的影響見圖1。

圖1 蛋白酶對泥鰍肽得率及水解度的影響Fig.1 Effect of various proteases on yield and hydrolysis of loach peptides

由圖1 可知，風味蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶水解度無顯著差異（P＞0.05），但堿性蛋白酶水解度以及肽得率均最高，分別為14.48%、24.30%；中性蛋白酶肽得率（18.26%）顯著低于風味蛋白酶（23.46%）和堿性蛋白酶（24.30%），堿性蛋白酶與風味蛋白酶肽得率無顯著差異（P＞0.05）。不同類型的蛋白酶水解度以及肽得率有所區(qū)別，這是由于蛋白酶在水解過程中具有專一性，不同蛋白酶有著不同的酶切位點，且主要酶切位點數量有差異，需根據實際的試驗材料篩選出酶解效果最佳的蛋白酶[20]。堿性蛋白酶價格低于風味蛋白酶，且在相同酶活下，堿性蛋白酶的使用量少于風味蛋白酶，可從一定程度上降低生產成本，亦有相應研究表明，堿性蛋白酶酶解后的肽，其分子量小于風味蛋白酶酶解的肽[21]。因此，選擇堿性蛋白酶為最適酶進行后續(xù)試驗。

2.2 泥鰍肽制備單因素試驗結果

2.2.1 酶解溫度對泥鰍肽得率的影響

酶解溫度對泥鰍肽得率的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對泥鰍肽得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on yield of loach peptides

由圖2 可知，隨著酶解溫度的升高，泥鰍肽得率呈先上升后下降的趨勢。酶解溫度為45 ℃時，肽得率達到最大值，顯著高于其他溫度下的肽得率（P＜0.05）；當酶解溫度超過45 ℃時，肽得率呈下降趨勢，這可能是由于溫度過高，部分蛋白酶活性降低，導致肽得率降低，故選擇45 ℃為最佳酶解溫度進行后續(xù)試驗。

2.2.2 pH 值對泥鰍肽得率的影響

pH 值對泥鰍肽得率的影響見圖3。

圖3 pH 值對泥鰍肽得率的影響Fig.3 Effect of pH on yield of loach peptides

由圖3 可知，隨著溶液pH 值增加，泥鰍肽得率呈先上升后下降的趨勢。當pH 值達到10.0 時，泥鰍肽得率顯著高于pH9.0 時的肽得率（P＜0.05），且泥鰍肽得率達到最大值；當pH 值大于10.0 時，泥鰍肽得率呈現逐漸下降的趨勢，這可能是由于隨著堿性的增強，酶活性逐漸降低；當pH 值為13.0 時，泥鰍肽得率迅速下降，這可能是由于過堿環(huán)境改變了蛋白酶空間構象，從而使蛋白酶失活[22]。故選擇pH10.0 進行后續(xù)試驗。

2.2.3 酶解時間對泥鰍肽得率的影響

酶解時間對泥鰍肽得率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對泥鰍肽得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of loach peptides

由圖4 可知，隨著酶解時間的延長，肽得率整體呈先上升后下降的趨勢。當酶解時間為60 min 時，泥鰍肽得率達到最大值。酶解時間超過60 min 時，隨著酶解時間的延長，泥鰍肽得率整體呈下降趨勢，推測原因可能是蛋白酶隨著酶解時間延長，酶與肽反應，將肽進一步水解為氨基酸，使得泥鰍肽得率下降。酶解時間為90、120、150 min 時的肽得率無顯著差異（P>0.05），故選擇酶解時間30、60、90 min 進行后續(xù)響應面試驗。

2.2.4 酶活對泥鰍肽得率的影響

酶活對泥鰍肽得率的影響見圖5。

圖5 酶活對泥鰍肽得率的影響Fig.5 Effect of enzyme activity on yield of loach peptides

由圖5 可知，隨著酶活的增加，泥鰍肽得率整體呈先上升后下降的趨勢。酶活在142、171 U/mL 時，泥鰍肽得率無顯著差異（P>0.05），而酶活在200、229、258 U/mL 時，肽得率均顯著高于142 U/mL 和171 U/mL酶活下的肽得率。當酶活達到229 U/mL 時，肽得率達到最大值。

底物濃度一定時，酶解反應速度與酶活呈正相關，酶與底物結合形成中間產物，從而使得泥鰍蛋白酶解更為徹底，當酶活超過229 U/mL 時，泥鰍肽得率呈現下降趨勢，推測可能是由于酶活過高，多余的蛋白酶與體系中的肽結合，將泥鰍肽進一步水解為氨基酸，從而導致泥鰍肽得率呈現下降趨勢。故選擇200、229、258 U/mL 進行響應面試驗。

2.2.5 料液比對泥鰍肽得率的影響

料液比對泥鰍肽得率的影響見圖6。

圖6 料液比對泥鰍肽得率的影響Fig.6 Effect of material-liquid ratio on yield of loach peptides

由圖6 可知，隨著溶液體積的增加，泥鰍肽得率整體呈先上升后趨于平緩下降的趨勢，當料液比為1∶12（g/mL）時，泥鰍肽得率達到最大值；當料液比為1∶14（g/mL）時，泥鰍肽得率有所降低，這可能是因為隨著溶液體積的增大，底物濃度變低，增加了酶與底物接觸的難度，使得泥鰍蛋白酶解不完全，難以被水解為泥鰍肽。料液比為1∶8（g/mL）時肽得率與料液比為1∶12（g/mL）時的肽得率無顯著性差異（P>0.05），料液比過高會增加后續(xù)濃縮的時間以及成本，故綜合考慮選擇1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）進行后續(xù)響應面試驗。

2.2.6 泥鰍肽制備響應面優(yōu)化試驗結果

響應面試驗設計及結果見表3，通過軟件（Design-Expert V8.0.6）計算出回歸方程，得出最佳制備工藝。

表3 泥鰍肽制備工藝優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and results for preparation process optimization of loach peptides

各因素與泥鰍肽得率之間的二次多元回歸方程為Y1=28.21+2.68A+1.76B+3.23C+3.26AB-1.54AC-1.18BC+2.21A2-2.94B2+0.043C2，該模型的方差分析見表4。

表4 肽得率的回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance for peptide yields

由表4 可以看出，該模型P＜0.01，故回歸模型極顯著，失擬項P 值為0.848 8，表示失擬項不顯著，模型相關系數R2為0.945 3>0.8，說明方程擬合度較好，可以用此模型對蛋白酶酶解泥鰍肽工藝進行優(yōu)化。對泥鰍肽得率影響大小排序依次為料液比>酶解時間>酶活。

對回歸模型進行響應面分析，結果見圖7。

圖7 各因素交互作用對泥鰍肽得率的影響Fig.7 Effect of interaction between factors on yield of loach peptides

由圖7 可知3 個交互項（AB、AC、BC）之間的相互作用。通過Design-Expert V 8.0.6 得出最佳條件為堿性蛋白酶酶活248 U/mL、酶解時間90 min、料液比1∶10（g/mL），此條件下肽得率預測值為36.10%。

2.2.7 泥鰍肽制備驗證試驗

為了驗證該響應面結果的可行性，在最優(yōu)條件下進行3 次試驗，所得泥鰍肽得率為（37.27±0.81）%，與預測值36.10%無顯著性差異。結果表明該響應面模型能夠較好地模擬試驗過程和預測泥鰍肽得率。因此酶解工藝條件為堿性蛋白酶酶活248U/mL、酶解時間90 min、料液比1∶10（g/mL）。本研究與游麗君等[8]、聶凌鴻等[9]最優(yōu)酶解工藝相比，在提高肽得率的同時，酶解時間顯著縮短。

2.3 脫色劑選擇結果

不同脫色劑對泥鰍肽酶解液脫色率以及肽保留率的影響見圖8。

圖8 不同脫色劑對泥鰍肽酶解液脫色率以及肽保留率的影響Fig.8 Effect of different decolorizing agents on decolorization and retention rates of loach peptides in enzymatic hydrolysates

由圖8 可知，在相同的脫色條件下，活性炭脫色效果較好，其脫色率較硅藻土差異不顯著（P>0.05），但肽保留率顯著高于硅藻土（P＜0.05），因此選擇活性炭為脫色劑進行后續(xù)試驗。

2.3.1 活性炭添加量對脫色率以及肽保留率的影響

活性炭添加量對脫色率以及肽保留率的影響見圖9。

圖9 活性炭添加量對脫色率以及肽保留率的影響Fig.9 Effect of activated carbon addition on decolorization rate and peptide retention rate

由圖9 可知，隨著活性炭添加量的增加，脫色率呈顯著上升趨勢（P＜0.05），而肽保留率整體呈下降趨勢。活性炭在脫色時，其特有的多孔結構能夠物理吸附色素。活性炭的添加量增加雖然能夠使脫色率逐漸上升，但其未與色素結合的多孔結構也能夠吸附泥鰍肽，因此會使泥鰍肽的保留率降低[23]。綜合肽保留率及脫色率的結果，選擇活性炭添加量為1.5%、2.5%、3.5%進行后續(xù)響應面試驗。

2.3.2 脫色時間對脫色率以及肽保留率的影響

脫色時間對脫色率以及肽保留率的影響見圖10。

圖10 脫色時間對脫色率以及肽保留率的影響Fig.10 Effect of decolorization time on decolorization and peptide retention rate

由圖10 可知，隨著脫色時間的延長，脫色率整體呈先上升后顯著下降的趨勢，脫色時間為90 min 時，肽保留率顯著大于75 min 時的肽保留率（P＜0.05）；但此時脫色率顯著小于75 min 時的脫色率（P＜0.05），而75 min 時的肽保留率顯著小于15、30、45、60 min 時的肽保留率。在一定時間內，隨著脫色時間的延長，色素分子能夠與活性炭表面充分接觸，但在活性炭吸附過程中，色素分子與泥鰍肽存在競爭吸附關系，隨著脫色時間延長，活性炭產生吸附解析，造成色素分子的釋放，使脫色率下降，而體系中的泥鰍肽被吸附入活性炭多孔結構內部的可能性增加，從而使肽保留率呈現下降的趨勢[24]。綜合肽保留率及脫色率的結果，選擇脫色時間為30、45、60 min 進行后續(xù)響應面試驗。

2.3.3 脫色溫度對脫色率以及肽保留率的影響

脫色溫度對脫色率以及肽保留率的影響見圖11。

圖11 脫色溫度對脫色率以及肽保留率的影響Fig.11 Effect of decolorization temperature on decolorization rate and peptide retention rate

由圖11 可知，隨著脫色溫度的升高，脫色率呈先上升后下降的趨勢，而肽保留率整體呈現逐漸下降的趨勢。當脫色溫度為30 ℃時，肽保留率顯著大于40、50、60 ℃時的肽保留率（P＜0.05），但此時脫色率顯著小于40、50、60 ℃的脫色率（P＜0.05）。

相關研究表明，活性炭脫色是吸熱過程，溫度升高的同時會使溶液體系黏度下降，有益于色素分子的擴散，使其更易于吸附到活性炭多孔組織內部，從而使脫色率增加，但溫度過高時，亦會產生吸附解析現象，吸附到活性炭多孔中的色素會被釋放出來[25]，并且過高的溫度會使泥鰍肽失活。綜合肽保留率及脫色率的結果，選擇脫色溫度為40、50、60 ℃進行后續(xù)響應面試驗。

2.3.4 pH 值對脫色率以及肽保留率的影響

pH 值對脫色率以及肽保留率的影響見圖12。

圖12 脫色pH 值對脫色率以及肽保留率的影響Fig.12 Effect of decolorization pH on decolorization rate and peptide retention rate

由圖12 可知，隨著pH 值的增加，肽保留率呈先顯著上升后顯著下降的趨勢，脫色率整體呈現逐漸下降的趨勢。當pH 值為3.0、4.0、5.0 時，脫色率以及肽得率顯著高于pH6.0、7.0、8.0 時的脫色率及肽得率，說明活性炭在酸性條件下脫色率較高，而在中性及堿性條件下脫色效果較差，這可能是由于pH 值的變化，能夠改變色素分子結構和電荷性質使其不易于被活性炭吸附，這與已有的報道結果相符[24]，試驗目的在于保證較高脫色率的同時肽保留率較高，故選擇脫色pH 值為3.0、4.0、5.0 進行后續(xù)響應面試驗。

2.3.5 脫色響應面優(yōu)化試驗結果

脫色響應面試驗設計及結果如表5 所示。

表5 泥鰍肽脫色工藝優(yōu)化響應面試驗設計Table 5 Response surface experimental design for decolorization process optimization of loach peptides

通過軟件，分析處理表5 中數據，可獲得各因子與泥鰍肽脫色率以及肽保留率之間的二次多元回歸方程：Y2=50.83＋2.75A'-1.81B'-2.29C'-13.5D'＋0.63A'B'-0.036A'C'＋3.72A'D'＋0.45B'C'-0.43B'D'-0.19C'D'-0.89A'2-0.16B'2＋0.0.24C'2-5.56D'2；Y3=91.82 -2.09A' ＋0.75B' ＋5.33C'-0.061 0D'＋2.24A'B'＋8.16A'C'-1.3A'D'-1.77B'C'＋3.81B'D'-0.84C'D'-9.73A'2＋0.86B'2-6.12C'2-7.13D'2。

脫色率及肽保留率回歸模型方差分析分別見表6和表7。

表6 脫色率的回歸模型方差分析Table 6 Regression model ANOVA for decolorization rates

表7 肽保留率的回歸模型方差分析Table 7 Regression model ANOVA for peptide retention rate

由表6 可知，脫色率回歸模型的P 值＜0.01，故回歸模型極顯著，失擬項P 值為0.071 2，表示為失擬項不顯著，模型相關系數R2為0.953 2＞0.8，說明方程擬合度較好，可以用此模型對泥鰍肽脫色工藝進行優(yōu)化。模型中信噪比為16.636＞4，說明試驗具有較高的精確度。響應面變異系數為6.34%＜10%，說明試驗可靠性較高，具有一定實踐指導意義。對脫色率影響大小排序依次為pH 值＞活性炭添加量＞脫色溫度＞脫色時間。

由表7 可知，肽保留率回歸模型的P 值＜0. 01，故回歸模型極顯著，失擬項P 值為0.721 7，表示為失擬項不顯著，模型相關系數R2為0.912 9＞0.8，說明方程擬合度較好，可以用此模型對泥鰍肽脫色工藝進行優(yōu)化。在本研究模型中信噪比為13.037，說明試驗具有較高的精確度。本試驗的響應面變異系數為4.19%，說明試驗可靠性較高，具有一定實踐指導意義。對肽保留率影響大小排序依次為脫色溫度＞活性炭添加量＞脫色時間＞pH 值。

對回歸模型進行響應面分析，結果見圖13～圖14。

圖13 各因素交互作用對泥鰍肽脫色率的影響Fig.13 Effect of interaction between factors on decolorization rate of loach peptides

圖14 各因素交互作用對泥鰍肽肽保留率的影響Fig.14 Effect of interaction between factors on retention rate of loach peptides

由圖13～圖14 可知各交互項（A'D'、B'D'、C'D'）以及（A'C'、A'D'、C'D'） 之間的相互作用。通過Design-Expert V8.0.6 得出最佳脫色條件為活性炭添加量2.47%、脫色時間30 min、脫色溫度53.97 ℃、pH3.32。脫色率以及肽保留率預測值分別為57.78%和93.34%。

2.3.6 脫色驗證試驗

為方便實際操作，將最佳脫色條件修正為活性炭添加量2.5%、脫色時間30 min、脫色溫度54 ℃、pH3.0，在此條件下進行3 次試驗，所得脫色率以及肽保留率分別為（57.91±0.19）%以及（94.90±0.02）%，均與預測值無顯著性差異。結果表明該響應面模型能夠較好地模擬試驗過程和預測脫色率以及肽保留率。因此最佳脫色條件為活性炭添加量2.5%、脫色時間30 min、脫色溫度54 ℃、pH3。

3 結論

通過分析比較5 種不同酶制備的泥鰍肽水解度以及肽得率，選取了堿性蛋白酶進行后續(xù)的單因素以及響應面試驗，獲得最佳泥鰍肽制備參數：酶解溫度45 ℃、pH10.0、酶解時間90 min、酶活248 U/mL、料液比1∶10 （g/mL）；最佳脫色工藝參數：活性炭添加量2.5%、脫色時間30 min、脫色溫度54 ℃、pH3.0。本研究所得泥鰍肽制備工藝及脫色工藝簡單，可為規(guī)模化生產提供參考，且能夠有效縮短泥鰍肽制備時間，提高酶解效率，有效改善泥鰍肽外觀品質，為泥鰍肽制備及脫色工藝優(yōu)化提供理論基礎。