CRISPR- Cas12a 檢測牛奶中大腸桿菌方法的建立與評價

冀霞，代紹密，余若菁，黃冰冰，劉家銘，李瑋瑋

（1.惠州學院，廣東 惠州 516007；2.惠州衛生職業技術學院，廣東 惠州 516025）

牛奶可以提供人類生長發育所需的多種營養物質，同時也是很多食品的原料，但因其營養豐富的特點極易受到細菌等微生物的污染[1]。結合現如今我國牛奶制品的質量安全情況，對牛奶安全生產體系的管控和質量安全檢測顯得尤為重要，尤其是對牛奶制品中有害微生物檢測技術的更新與升級[2-3]。當前，對牛奶等食品中大腸桿菌的檢測方法包括計數檢測法、免疫學法、實時熒光定量檢測法、基因芯片技術等，然而這些技術都存在諸多弊端，如傳統的微生物檢測方法需要經過選擇性培養、純化、生化反應等步驟，存在操作復雜、檢測周期長等不足[4-5]；免疫學法受自身抗體、嗜異性抗體等干擾因素影響，易出現假陽性[6-7]；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測法和基因芯片技術等，存在試驗平臺要求苛刻、成本高的問題[8]。因此，迫切需要研究建立快速、精確且經濟的檢測牛奶中大腸桿菌的識別體系。

成簇的規則間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）常存在于部分細菌和大部分古細菌中，CRISPR 相關蛋白（CRISPR-associated protein，CRISPR-Cas）是用來抵御外來病毒或噬菌體基因入侵自身基因組的免疫防御系統[9-10]。當細菌抵御噬菌體等外源DNA 入侵時，在前導區的調控下，轉錄形成含有保守重復序列和間隔區的CRISPR RNA（crRNA），并在效應蛋白的協助下，最終識別并結合到與其互補的外源DNA 序列上，發揮剪切作用[11-12]，形成防御病毒和其它外來DNA 侵入的免疫系統。CRISPR-Cas12 和CRISPR-Cas13 是近年來被發現的新型基因編輯系統[13-15]，較之前的CRISPR-Cas9系統，有很大改進，尤其是功能性方面。Kellner 等[16]研究發現CRISPR-Cas13 可以特異性識別并直接剪切RNA，已被廣泛應用于病毒檢測。而CRISPR-Cas12，又稱Cfd1，只能特異性識別并直接剪切DNA 雙鏈結構[17-18]，相對CRISPR-Cas13，其更適合研發檢測基因組鑒定細菌的技術。

本研究基于CRISPR-Cas12a 蛋白剪切編輯系統的原理，以大腸桿菌16S rDNA 保守區為特異性識別位點，構建CRISPR-Cas12a 識別體系，并用以檢測被污染牛奶中的大腸桿菌。以期提高牛奶中大腸桿菌的檢測效率，提升乳源安全水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗使用的大腸埃希菌（E. coli MG 1655、E. coli ATCC 25922、E. coli BL21、E. coli DH5α）均保存在惠州學院天然產物實驗室。

LB 固體培養基、LB 液體培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（lsopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA） 法蛋白質定量檢測試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；氨芐青霉素（100 mg/mL）：上海麥克林生化科技有限公司；羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、Tris 緩沖溶液、DNA Marker、Ex Taq DNA 聚合酶鏈式反應擴增試劑盒、限制性內切酶Sac I 和BamH I：寶日醫（北京）生物技術有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒：康寧生命科學（吳江）有限公司；質粒pMBP-Cas12a：美國Addgene 公司；質粒快速提取試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；蛋白質Marker、考馬斯亮藍染色液、十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

ABI-9700 PCR 基因擴增儀：美國Applied Biosystems 公司；ZHTY-50N 振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；NanoDrop 2000 微量分光光度計、Sorvall Legend Micro 21R 高速冷凍離心機：美國賽默飛公司；Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統：美國Bio-Rad 公司；GHP-9050 隔水式培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；HH-1 數顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；QQ-150Y 超聲波細胞粉碎機：上海啟前電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表達載體構建及鑒定

根據Cas12a（Cpf1）的基因序列，設計引物Cpf1-F：CCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAAC AACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGGAA AACCTGTACTTCCAATCCAATGC；Cpf1-R：TTATTTAA TTACCTGCAGGGAATTCGGATCCTTATTAATGTTTCAC GCTGGTCTGCGCAT，并以2 μL 的pMBP-Cas12a 質粒為模版，對Cas12a 目的片段進行PCR 擴增，PCR 反應體系中，加入2.5 μL 10×PCR 緩沖液，2 μL 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），0.5 μL Cpf1-F 引物，0.5 μL Cpf1-R 引物，0.125 μL Ex Taq酶，用雙蒸水補齊至25 μL。反應條件設置：98 ℃預變性1 min；98 ℃保持30 s，52 ℃保持30 s，72 ℃保持2 min，35 個循環；72 ℃延伸5 min，并將PCR 擴增產物進行膠純化回收。將膠回收的Cas12a PCR 目的片段與Sac I和BamH I 酶切并膠回收的pMAL-c5x 質粒連接，將連接產物轉化到DH5α 感受態細胞中，在含有100 μg/mL氨芐青霉素抗生素的LB 固體培養基上過夜培養。挑取培養基上的單菌落進行PCR 驗證，并測序，獲得重組質粒pMAL-c5x-Cas12a。

1.3.2 Cas12a 蛋白的表達純化

用質粒提取試劑盒提取重組的pMAL -c5x -Cas12a 質粒，并轉入E. coli（BL21）中。將轉入質粒的細菌過夜培養，1∶100 的體積比轉接于含有100 μg/mL 氨芐青霉素抗生素LB 液體培養基中，培養至OD600約為0.6，加入1 mmol/L 的IPTG，繼續誘導4 h。PBS 重懸誘導后收集的菌體，并超聲破碎（6 mm 變幅桿，52.5 W，工作3.5 s，間隙7 s）至菌液透明。10 000 r/min 離心15 min，去除細胞碎片，吸取50 μL 上清液保留，將剩余上清液在4 ℃、10 000 r/min 條件下繼續離心15 min，分離上清液和沉淀，吸取上清液，沉淀加200 μL 的PBS 重懸，分離蛋白與蛋白上樣緩沖液混合，100 ℃沸水浴5 min，10 000 r/min 條件下離心5 min，取20 μL 進行SDSPAGE，濃縮膠恒壓80 V、分離膠電壓120 V，0.1%考馬斯亮藍染色30 min，脫色液脫色至蛋白質條帶清晰，并拍照分析。

使用平衡緩沖液（Tris-NaCl，pH8.0）對麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein，MBP）親和層析柱進行平衡，利用MBP 柱親和層析柱對帶有MBP 標簽的Cas12a 蛋白進行吸附純化，用平衡緩沖液（Tris-NaCl，pH8.0） 對未結合的雜蛋白進行洗滌，用洗脫緩沖液（Tris-NaCl，pH8.0，10 mmol/L 麥芽糖） 對吸附在MBP純化柱上的Cas12a 蛋白進行洗脫。將洗脫的蛋白放置于含有20 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl 的pH8.0 緩沖液中，4 ℃透析過夜。然后，用含有20 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl 的pH8.0 溶液平衡Superdex 200，將酶切的Cas12a 蛋白，用凝膠過濾層析柱進行純化。取純化的Cas12a 蛋白進行SDS-PAGE。

1.3.3 設計crRNA

根據京都基因與基因組百科全書數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），獲取大腸桿菌（E. coli）K12-MG1655 的16S rDNA 序列，設計crRNA[19]。crRNA 形成莖環結構的直接重復序列為AA-UUUCUACUAAGUGUAGAU，間隔序列與靶序列互補，T 被U 取代。選取crRNA：5'- UUUGAGUUUUAACCUUGCGGCCGU -3'，進行定制合成。

1.3.4 大腸桿菌污染牛奶的制備

取大腸桿菌標準質控菌株ATCC 25922 接種于3 mL LB 液體培養基中，37 ℃，200 r/min 過夜培養，取100 μL 菌液與900 μL 牛奶混勻，為10-1稀釋，依次用牛奶對大腸桿菌進行稀釋，至10-9，制成不同濃度滴度的大腸桿菌污染牛奶液。取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度的牛奶污染樣品涂布，平行3 次，37 ℃過夜培養后，對污染牛奶進行菌落統計分析，根據GB 4789.38—2012《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數》計算各稀釋梯度培養基上的菌落數，并表示為菌落形成單位CFU/mL，得到牛奶中大腸桿菌菌落總數，用GraphPad prism 進行數據分析。同時，取40 μL 各個稀釋度的牛奶污染液，至2 mL LB 液體培養基，37 ℃、200 r/min 過夜培養，進行增菌。

1.3.5 PCR 擴增

將牛奶污染樣品10 000 r/min 離心3 min 后，棄去上清液，加入100 μL 純水重懸，95 ℃水浴10 min 后12 000 r/min 離心10 min，取上清液作為PCR 模板。應用合成的16S rDNA 序列通用引物27F：AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG；1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT 進行PCR 擴增。PCR 反應體系為2.5 μL PCR 緩沖液，2 μL dNTP，0.5 μL 27F 引物，0.5 μL 1492R 引物，0.125 μL Ex Taq 酶，2 μL 模板，用雙蒸水補齊至25 μL。反條件設置為98 ℃預變性1 min；94 ℃保持30 s，52 ℃保持30 s，72 ℃保持2 min，35 個循環；72 ℃延伸5 min，16 ℃保存，并將PCR 擴增產物進行膠純化回收。

1.3.6 Cas12a 切割活性檢驗

根據文獻[20]的方法，在酶切反應體系中，加入0.5 μL 1 mol/L N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（2-[4-（2 -hydroxyethyl）piperazin -1 -yl]ethanesulfonic acid，HEPES），3.75 μL 1 mol/L KCl，2.5 μL 100 mmol/L MgCl2，0.25 μL 10 % 甘油，1.25 μL 10 mmol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），純化的97 ng MG1655 16S rDNA PCR 產物，以及按照3∶4 的摩爾比分別加入不同濃度的純化后的30 nmol/L Cas12a 和40 nmol/L crRNA；50 nmol/L Cas12a 和66.67 nmol/L crRNA；100 nmol/L Cas12a 和133.3 nmol/L crRNA，純水補齊至25 μL，37 ℃孵育2 h 后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 統計分析

每組試驗平行進行3 次，數據通過GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析和繪圖，兩組計量數據比較采用Student's t 檢驗統計學分析，P＜0.05 為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 Cas12a 蛋白表達載體構建

pMAL-c5x-Cas12a 質粒構建結果驗證見圖1。

圖1 pMAL-c5x-Cas12a 質粒構建Fig.1 pMAL-c5x-Cas12a plasmid construction

根據Cas12a（Cpf1）的基因序列，利用設計合成的上下游引物（Cpf1-F，Cpf1-R），以pMAL-c5x-Cas12a質粒中的Cas12a 序列為模版進行PCR 擴增后，得到3816 bp 大小的片段，與預測的片段大小相符（圖1A）。對Cas12a 的PCR 產物進行膠回收，將膠回收的PCR產物與Sac I 和BamH I 酶切后的pMAL-c5x 質粒進行連接轉化，通過100 μg/mL 氨芐青霉素抗生素的LB固體培養基篩選，隨機選取8 個單菌落進行PCR 鑒定并測序分析，PCR 產物大小為3 920 bp 的單菌落為陽性，共獲得5 個陽性菌落（圖1B），隨機選擇3 個陽性菌落進行測序，所得陽性菌落均比對成功，pMAL-c5x-Cas12a 質粒構建成功。

2.2 Cas12a 蛋白表達

Cas12a 蛋白誘導少量表達結果見圖2。

圖2 Cas12a 蛋白誘導表達Fig.2 Cas12a protein expression

將構建成功的pMAL-c5x-Cas12a 質粒轉化到BL21 感受態細胞中，加入IPTG 誘導表達，以不加IPTG 的菌液蛋白做為陰性對照，進行少量表達。蛋白SDS-PAGE 結果顯示，加入IPTG 誘導后，總蛋白、上清液和沉淀樣品中均出現了130 kDa 左右的條帶，且比不加誘導劑組的蛋白條帶明顯增強，大小也與Cas12a蛋白一致，說明Cas12a 蛋白表達成功。

2.3 Cas12a 蛋白純化

Cas12a 蛋白純化結果見圖3。

圖3 Cas12a 蛋白純化Fig.3 Cas12a protein purification

根據1.3.2 誘導表達條件，將Cas12a 蛋白進行大量表達，獲得的蛋白上清通過MBP 親和層析柱進行純化，對純化獲得的Cas12a 蛋白進行酶切消化，最后用凝膠過濾層析的方法除去剩余的雜質蛋白。通過SDSPAGE 和考馬斯亮藍染色驗證，與未經蛋白純化的對照組相比，洗脫樣中，泳道5～7 有比較明顯的分子量為130 kDa 蛋白條帶，且其含量和純度較好（圖3）。因此，將上述3 種回收的蛋白進行混和、分裝，作為構建CRISPR-Cas12a 檢測體系的Cas12a 蛋白。

2.4 Cas12a 蛋白酶切活性檢驗

Cas12a 蛋白酶切大腸桿菌K12 -MG1655 的16S rDNA 序列結果見圖4。

圖4 Cas12a 蛋白酶切大腸桿菌K12-MG1655 的16S rDNA 序列Fig.4 Cas12a protease digested 16S rDNA sequence of E. coli K12-MG1655

利用細菌16S rDNA 序列的通用引物27F、1492R，對大腸桿菌K12-MG1655 的16S rDNA 序列進行PCR擴增，核酸電泳檢測結果顯示，獲得1 542 bp 的擴增產物（圖4A）。將擴增的PCR 產物進行膠回收純化，按30∶40 物質的量濃度加入Cas12a 純化蛋白和crRNA進行酶切，陰性對照組用無菌水代替Cas12a。核酸電泳檢測酶切結果顯示（圖4B），Cas12a 濃度為30 nmol/L、crRNA 濃度為40 nmol/L 時，呈現出890 bp 和1 542 bp兩種條帶，說明K12-MG1655 的16S rDNA 序列未完全酶切；Cas12a 濃度為50 nmol/L、crRNA 濃度為66.67 nmol/L 時，呈現出890、628 bp 和1 542 bp 3 種條帶，說明K12-MG1655 的16S rDNA 序列未完全酶切，但酶切條件明顯優化；Cas12a 濃度為100 nmol/L、cr－RNA 濃度為133.3 nmol/L 時，呈現出明顯的890 bp 和628 bp 兩種條帶，且無1 542 bp 條帶，說明K12-MG1655的16S rDNA 序列在此條件下完全酶切。根據酶切結果，100 nmol/L 蛋白濃度的MG1655 切割效果較好，將此條件作為構建CRISPR-Cas12a 檢測體系。

2.5 CRISPR-Cas12a 檢測體系檢測牛奶中大腸桿菌

牛奶樣品的菌落總數結果見圖5。CRISPR-Cas12a體系檢測牛奶中大腸桿菌結果見圖6。

圖5 污染大腸桿菌牛奶樣品的菌落總數結果Fig.5 Total viable count of E. coli-contaminated milk samples

圖6 CRISPR-Cas12a 體系檢測牛奶中大腸桿菌Fig.6 Detection of E. coli in milk by CRISPR-Cas12a system

從圖5 中可看出，不同濃度污染的牛奶中大腸桿菌數量存在顯著性差異。將感染不同濃度大腸桿菌的牛奶樣品用LB 液體培養基以1∶100 體積比稀釋，過夜培養，進行增菌，收集增菌后的菌液，并用細菌16S rDNA 序列的通用引物27F、1492R 進行PCR 擴增。從圖6 核酸電泳檢測結果顯示，不同濃度污染的牛奶均可獲得1 542 bp 的擴增產物條帶（圖6A）。根據上述結果，采用100 nmol/L Cas12a、133.3 nmol/L crRNA濃度的CRISPR-Cas12a 檢測體系對純化的大腸桿菌ATCC25922 16S rDNA 序列的PCR 純化產物進行酶切，不加CRISPR-Cas12a 檢測體系純化的16S rDNA序列的PCR 產物作為陰性對照，并進行核酸電泳檢測。結果顯示，CRISPR-Cas12a 檢測體系組呈現出890 bp和628 bp 條帶，沒有加入檢測體系的對照組DNA 片段沒有被酶切（圖6B），牛奶中的大腸桿菌基于CRISPRCas12a 的檢測體系建立成功。

3 結論

基于CRISPR-Cas12a 的基因編輯技術，本研究成功表達、純化了CRISPR-Cas12a 蛋白，并用純化的CRISPR-Cas12a 蛋白、特異性的crRNA 等的混合體系，對目的基因16S DNA 準確完成靶向切割，成功構建以大腸桿菌為模型的一種細菌檢測體系。牛奶作為人們日常生活中主要營養攝取源，其質量安全直接影響人們身體健康，本研究建立的CRISPR-Cas12a 系統可檢測牛奶中的大腸桿菌，具有特異性強、靈敏度高、檢測速度快等特點，為提高乳源中細菌的特異性檢測效率奠定了基礎。