微生物胞外多糖結構與活性研究進展

李春雨，屈建航，周佳

（河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001）

多糖通常是由十幾種單糖通過糖苷鍵連接并組合而形成的復雜結構高分子聚合物，是生命組成的四大基本物質之一[1]。微生物多糖是一類豐富且重要的化合物，主要由細菌、真菌和藻類分泌。根據多糖在細胞中的不同位置，可以分為胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、胞壁多糖和胞內多糖三大類[2]。微生物胞外多糖是一些特殊微生物通過碳源的吸收同化在細胞內產生并分泌到細胞壁外的聚合物，屬于微生物的次級代謝產物。胞內多糖和胞壁多糖產量低，成分復雜，雜質多，提取純化不易，相比之下，微生物胞外多糖生產周期短，易分離純化，具有更高的經濟效益[3]。

胞外多糖是微生物產生的重要代謝物，這些EPS分子主要負責生物膜的形成，也參與細胞防御機制，保護菌體免受外界環境壓力[4]。大量研究表明，微生物EPS 具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖、乳化、絮凝等多種生物活性[5]，除此之外，微生物EPS 不僅是天然化合物，而且屬于可再生可持續發展的資源，應用范圍非常廣泛，其中普魯蘭多糖、結冷膠及黃原膠等多個產品已應用于醫藥、食品、化工等多個領域[6]。

微生物EPS 的來源不同，其結構與功能也各不相同。因此，本文對微生物胞外多糖的結構表征及生物活性進行歸納總結，并探討二者之間的構效關系，以期為微生物EPS 在食品、藥品、化工等領域的研究與應用發展提供思路和理論依據。

1 微生物胞外多糖的結構

1.1 初級結構

微生物胞外多糖的結構分為初級（一級）結構和高級（二、三、四級）結構。初級結構主要包括胞外多糖的分子量、單糖組成及比例、異頭碳構型、糖苷鍵類型、糖鏈中糖基排列順序和分支情況、單糖殘基上的羥基取代狀況等[7]。對于多糖一級結構的分析方法主要分為物理、化學和生物學三大類，如表1 所示。通常采用色譜法測定分子量（高效液相色譜或凝膠排阻色譜）和單糖組成及比例（氣相色譜或液相色譜），采用紅外光譜法對異頭碳構型進行分析，采用甲基化和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對單糖連接次序以及化學基團等進行表征分析。

表1 胞外多糖初級結構分析方法Table 1 Methods for primary structure analysis of exopolysaccharides

目前，已報道的產胞外多糖的微生物主要有乳桿菌（Lactobacillus sp.）[8]、芽孢桿菌（Bacillus sp.）[5]、魏斯氏菌（Weissella sp.）[9]、明串珠菌（Leuconostoc sp.）[10]、發酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus sp.）[11]腸球菌（Enterococcus sp.）[12]、毛霉（Mucor sp.）[13]、小球藻（Chlorella sp.）[14]等，這些多糖種類繁多、結構復雜，通常采用多種方法綜合運用，解析多糖的結構，具體表征方法及研究結果如表2 所示。

表2 胞外多糖初級結構研究進展Tab le 2Rese arch progres s in primary structures of exop olysaccharides

1.2 高級結構

多糖結構的研究晚于蛋白質和核酸，且多糖結構比蛋白質和核酸的結構更加復雜，目前關于微生物EPS高級結構的研究尚處于起步階段。Vinothkanna 等[21]通過原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）在分子水平上直接觀察到地衣芽孢桿菌AG-06 EPS 在分子間、分子內聚集，形成球形團塊和鏈狀特征且球形結構的尺寸遠大于鏈狀多糖。徐淵美[22]通過剛果紅試驗檢測植物乳桿菌KX041 EPS-3 是否具有三螺旋構象，結果顯示在弱堿環境下，EPS-3 與剛果紅聚合物產生了紅移，表明其具有三螺旋結構。除此之外，還可通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）、X-射線衍射（X -ray diffraction，XRD）、 圓二色譜（circular dichroism，CD）、分子模擬技術等方法對多糖高級結構進行表征[23-24]。目前國內外關于解析胞外多糖高級結構的相關報道較少，這主要與多糖結構復雜、解析難度高、解析技術水平相對有限等原因有關。

2 胞外多糖的活性

2.1 抗氧化活性

自由基和活性氧在人體的新陳代謝活動中發揮著重要的調節作用，但含量過高時會產生氧化應激反應，使細胞膜破壞、核酸斷裂、蛋白質損壞等，進而引發氧化應激性相關疾病[25]。清除氧活性化自由基是抗氧化藥物發揮其藥效的一個重要途徑。目前食品工業中廣泛應用的抗氧化劑主要有沒食子酸酯、丁基羥基茴香醚、2，6-二叔丁基甲酚、三羥基苯丁酮等，這些抗氧化劑均是合成的，不僅具有一定毒性而且生產成本高，因此對天然抗氧化劑的研究和開發受到了國內外研究者的廣泛關注[26]。

許多研究表明，微生物EPS 具有較好的抗氧化能力，能減輕自由基等對機體造成的氧化損傷。通過自由基清除和還原力測試的方法，研究發現來自細菌[27-28]、真菌[29]、藻類[30]等微生物的胞外多糖都具有自由基清除能力和還原能力，且表現出較好的抗氧化活性。除此之外，胞外多糖還可改善細胞抗氧化的能力。Wang等[31]探究了球毛殼菌CGMCC 6882 EPS 對巨噬細胞抗氧化的影響，結果表明該多糖可通過增強巨噬細胞內抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶）的活性和總抗氧化能力以及減少丙二醛的含量顯著提高細胞的活力。Wang 等[32]研究了發酵乳桿菌S1 的EPS對秀麗隱桿線蟲抗氧化的影響，結果表明，該EPS 可顯著提高線蟲體內總抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量水平，顯著改善線蟲體內抗氧化狀態。這些研究結果表明，微生物EPS 有可能成為一種天然抗氧化劑在食品、藥品等行業中應用。

2.2 抗腫瘤活性

癌癥是主要公共衛生問題之一，癌細胞是惡性腫瘤中最常見的一類。大量研究表明，EPS 具有抗腫瘤活性，其作用機制主要分為兩種：一種是直接作用于腫瘤細胞，直接誘導腫瘤細胞分化和凋亡等；另一種是作用于宿主細胞，通過提高宿主的免疫功能抑制腫瘤細胞生長或殺死腫瘤細胞[33]。

大量研究報道了微生物EPS 的抗腫瘤活性。海洋芽孢桿菌EPS 濃度超過50 μg/mL 時具有顯著抑制HeLa 細胞增殖的作用[34]。副干酪乳桿菌EPS 對Caco-2細胞作用72 h 時的抑制率達到19.5%（500 μg/mL），該EPS 可通過影響Caco-2 細胞凋亡相關蛋白的表達直接促進腫瘤細胞凋亡[35]。低劑量粒毛盤菌胞外多糖硒納米顆粒可有效抑制小鼠腫瘤生長及腫瘤細胞的增殖，除此之外，可增加血清中的免疫因子白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-1-β、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ） 和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）的質量濃度，繼而激活抗腫瘤免疫系統抑制腫瘤的生長[36]。深海細菌EPS 對肝癌細胞Bel-7402 和Huh7.5 均具有較好的生長抑制作用，對兩種細胞系的抗腫瘤作用的IC50為0.4～0.5 mg/mL，構建抗腫瘤模型發現，該EPS 通過靶向FGF19-FGFR4 信號通路發揮抗腫瘤作用[37]。真菌胞外多糖羧甲基化后，降低了MCF-7 細胞的增殖，降低細胞形成菌落和在細胞外基質中遷移的能力[38]。

2.3 抗炎癥活性

炎癥因子的過度表達會造成細胞、組織、器官的損傷，甚至會促使腫瘤生長，因此消除炎癥因子并恢復免疫穩態對保護機體具有重要意義。EPS 可起到抑制感染，預防和治療炎癥的作用，一般是通過調節炎癥信號分子來調節免疫系統的應答反應，從而發揮其抗炎癥活性[39]。

EPS 的抗炎活性研究主要以巨噬細胞等免疫細胞為載體，Zhang 等[40]從沼澤紅假單胞菌提取胞外多糖，體外免疫試驗表明，其EPS 可激活巨噬細胞的吞噬能力，并且可以促進腸道有益菌群的生長。周興濤[41]研究發現，植物乳桿菌NCU116 EPS 可減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎癥，機制探究結果表明，EPS 可促進緊密連接蛋白的表達調節轉錄因子STAT3 信號通路，調節腸道黏膜屏障功能，從而減輕炎癥。房曉彬[42]發現，植物乳桿菌EPS103 對巨噬細胞RAW264.7 具有雙重體外免疫調節作用，一方面，在未被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 激活的巨噬細胞中，EPS103可顯著增強細胞的吞噬能力，并促進促炎細胞分子（IL-6、TNF-α 和NO）的分泌；另一方面，在LPS 激活的巨噬細胞中，EPS103 能顯著抑制促炎細胞分子產生以及相關基因的表達，緩解LPS 對細胞產生的刺激，說明EPS 既可以適當促進炎癥反應，加快機體修復，也可以抑制促炎分子分泌，防止過度免疫。

2.4 抑菌活性

濫用抗生素帶來的耐藥性細菌日益增多已成為一個世界性的問題，除了對抗生素的使用進行更科學的管理外，還迫切需要開發更加綠色高效的抗生素替代品[43]。多糖的抑菌機制主要有抑制細菌生物膜的形成、阻礙細菌代謝、破壞細菌細胞壁和細胞膜、降低基因轉錄水平等[44]。

唐少軍等[45]對粗毛纖孔菌EPS 抑菌能力進行了探究，結果發現該EPS 對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌均有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑分別為12、11、11 mm。淡水微藻的EPS 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑可以達到14.72 mm，表現出較強的抑菌能力[46]。Xu 等[47]研究發現，干酪乳桿菌EPS 對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157∶H7 均有抑制作用，該EPS 可通過抑制生物膜的形成和分散病原菌發揮抗菌性能。Hu 等[15]發現，乳桿菌PW-7 EPS 具有抑菌作用且對幽門螺桿菌的最低抑制濃度為50 mg/mL，抗菌機理研究結果表明該EPS通過破壞幽門螺桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞膜發揮其抗菌作用。

2.5 其他活性

微生物胞外多糖除上述活性外，還具有乳化、保濕、金屬離子吸附等活性。楊艷芳[48]對檸檬明串珠菌N21 的EPS 進行乳化試驗，結果顯示，7 d 與24 d 時該EPS 對葵花油的乳化指數與24 h 的乳化指數無顯著差異，表明其具有良好的乳化穩定性，可作為食品添加劑提高食品的乳化穩定性。曹永強等[49]研究兩株植物乳桿菌EPS 的乳化特性，結果表明二者均可形成相對較小的乳化顆粒，且兩者的胞外多糖均對十六烷有極強的乳化效果，24 h 內最高可達（93.01±2.29）%和（83.33±1.21）%。周璇[50]對地衣芽孢桿菌Ⅱ4-01 胞外多糖在不同環境中的吸濕活性和保濕活性進行了探究，結果顯示在相對濕度為43%和81%環境中，純多糖的吸濕能力強于殼聚糖和黃原膠；在相對濕度0%（干燥硅膠）環境中，多糖的保濕活性明顯高于殼聚糖和黃原膠。關志國等[51]在研究中采用紅球菌HX-2 產生的EPS 吸附水體中的Cu2＋，經模型擬合得到最大吸附量，為144.93 mg/g，這一特性可應用于工業廢水中重金屬離子的治理。

EPS 因具有特殊的理化性質，在食品中添加EPS成為一種功能性食品開發的研究方向。賴田甜等[52]在植物乳桿菌NMGL2 對鮮牛乳發酵過程中添加胞外多糖，結果表明其能顯著提高發酵乳的彈性和黏性，顯著降低流動性和硬度。張逢溫等[53]研究發現，融合魏斯氏菌胞外多糖對無蛋蛋糕面糊特性和烘焙品質具有顯著的改善作用。Yuan 等[54]將強雄腐霉胞外多糖PEPS-2 應用于草莓保鮮中，結果顯示該多糖可顯著提高草莓采后的生理品質，有效延緩草莓腐爛、延長草莓貨架期。總之，EPS 具備的優良特性可使其作為天然食品添加劑，如抗氧化劑、穩定劑、增稠劑等應用在食品行業中。

3 胞外多糖結構與活性的構效關系

微生物EPS 的生物活性與結構息息相關，多糖的結構影響其物理性質，從而對生物活性產生影響。明晰多糖結構與活性之間的構效關系有利于功能性多糖的特異性篩選和應用。由于多糖結構復雜，解析難度大，目前對結構與活性的構效關系研究還不夠深入，但根據目前的研究探索可知多糖的單糖組成、分子量、糖苷鍵、分子構象、取代基等對多糖功能均具有不同程度的影響。

單糖是EPS 最基礎的組成單元，與EPS 的活性緊密相關。Zhu 等[55]從菌株SJ14 中分離得到的兩種富含甘露糖的胞外多糖EPS-1（75.9%）和EPS-3（28.7%）均表現出較好的自由基清除活性，且EPS-1 的清除活性顯著高于EPS-3，表明EPS 中含有甘露糖可能使其具有較強的抗氧化活性。Lo 等[56]以香菇多糖為樣品探究了抗氧化性與單糖組成之間的關系，結果表明，隨著鼠李糖和甘露糖含量的增加，抗氧化性能也隨之增大。EPS 分子量的大小對生物活性的發揮具有重要影響，與較大的EPS 相比，低分子量EPS 中存在更多的游離還原羥基末端，而且更容易穿透細胞，可通過羥基提供電子或氫發揮自由基清除能力，保護細胞免受自由基損傷[11]，在提高其抗氧化活性方面起著至關重要的作用[57]。而較大分子量的EPS 與抗腫瘤活性相關，不同種類的多糖發揮抗腫瘤活性的分子量分段不同，通常情況下，在一定濃度范圍內，分子量越高的多糖水溶性越高，抗腫瘤活性也越強[58]。EPS 的糖苷鍵對其生物活性同樣具有重要的影響，目前尚未有確切定論，但在當前研究中發現了一些規律，如α-（1→6）-糖苷鍵對EPS 清除反應具有積極作用，因為這種鍵可以提供靈活的區域，增加活性基團與自由基相互作用的可及性[11]。一些以β-（1→2）連接的葡聚糖、半乳糖和甘露糖，大多具有抗腫瘤活性，以β-（1→6）連接的葡聚糖不具有抗腫瘤活性[59]。除此之外，EPS 的生物活性與三螺旋結構也關聯密切，尤其是免疫調節和抗癌作用方面[60]。Kojima 等[61]研究發現，如果三螺旋結構消失，發生解旋，會極大降低多糖的活性，造成多糖的抗腫瘤活性消失。Zhang 等[62]研究發現，不同種香菇多糖在分子質量相近的情況下，具有三螺旋結構的香菇多糖對肉瘤S-180 細胞的抑制率高于不具有三螺旋結構的香菇多糖。

4 結論與展望

微生物胞外多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、乳化等多種生物活性，且毒副作用小，可成為化學合成聚合物的替代品，在食品、藥品、化妝品等行業具有較大的應用潛力，成為近年來的研究熱點之一。微生物胞外多糖的這些活性與其單糖組成、分子量、糖苷鍵等結構密切相關。目前關于胞外多糖的活性研究較多，但結構復雜，解析困難，未能深入挖掘生物活性與結構的構效關系。除此之外，有關胞外多糖的研究大多數為實驗室規模，無法滿足大規模生產，胞外多糖的放大應用研究仍需突破。