卵子激活劑A23187對睪丸精子卵胞漿內單精子顯微注射后妊娠結局的影響

閆學花,陳文楠,朱雅婷,劉小華,師娟子

(1.西北婦女兒童醫院生殖中心,陜西 西安 710003;2.陜西省婦科疾病臨床研究中心,陜西 西安 710003)

卵胞漿內單精子注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)已成為一種越來越普遍的輔助生殖技術,適用于少精癥、弱精子癥和畸胎癥[1]。盡管可以達到約70%受精率,但仍然存在1%～5%的完全受精失敗,ICSI后完全受精失敗主要歸因于卵母細胞活化不足。有研究報道,卵子激活技術能夠改善明確精子相關的卵母細胞活化不足的夫婦臨床結局[2-4],同時卵子激活劑A23187能夠提高凍融睪丸精子的ICSI效率[5-6]。本文利用真實世界的臨床數據,采用傾向評分匹配(propensity score matching,PSM)的方法來減少偏倚,通過比較卵子激活劑A23187誘導的卵子激活術( artificial oocyte activation,AOA)對新鮮睪丸精子ICSI后的胚胎發育和臨床結局的影響,旨在為AOA的臨床應用提供進一步的依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月至2020年4月期間在西北婦女兒童醫院生殖中心睪丸取精術(testicular sperm aspiration,TESA)后行ICSI的374對不孕夫婦作為研究對象,按照ICSI后是否采用卵子激活劑A23187行人工卵子激活術隨機分為卵子激活組(n=47)和常規對照組(n=327),所有參與者均為第二周期及多周期患者。納入的所有研究對象均知情同意自愿參與治療,本研究經西北婦女兒童醫院生殖醫學倫理委員會批準(審批編號:2022007)。

1.2 促排卵方案

所有患者均采用拮抗劑方案(拮抗劑高、中、低方案)、激動劑方案(長方案、超長方案、短方案和超短方案)和其他方案(自然周期、黃體期促排卵子方案、微刺激方案和安宮周期),所有患者在促排卵8～14d后,當≥2個卵泡直徑≥18mm,或者3個卵泡直徑≥17mm時皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤,默克雪蘭諾,英國)250μg或注射用人絨毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotrophin,HCG,珠海麗珠制藥)5000～1000U扳機。扳機后,32～36h經陰道超聲下取卵,取出后,將卵冠丘復合體迅速放入培養液,38～40h后選取成熟卵子(metaphase Ⅱ,MⅡ)行ICSI。

1.3 睪丸精子的獲得及卵子激活

患者于局部麻醉的狀態下行TESA術,繃緊陰囊皮膚,采用睪丸穿刺針垂直扎入陰囊皮膚,利用負壓抽取少量睪丸組織并放入培養液中,在顯微鏡下用1mL注射器劃破睪丸組織,觀察是否達ICSI標準,達標后將睪丸精子加入盤中備ICSI用。

ICSI后,將存活的卵子用巴士吸管立即轉移到預平衡好的30μL即用型卵子激活劑 (GM508 CultActive,Ca2+Ionophor A23187,德國 Gynemed公司)的培養滴中,孵育15min后用培養液G-1充分洗滌2～3遍后放入新的G-1液滴中,置于37℃、6%二氧化碳培養箱中進行后續培養。

1.4 受精判斷、胚胎培養及評級

ICSI后18～19h觀察卵胞漿出現雙原核(2PN)為正常受精,其余為異常受精或者未受精。在胚胎培養第3天選擇1～2個胚胎進行移植,或繼續培養至第5天進行囊胚移植,或冷凍保存后行冷凍胚胎或冷凍囊胚移植。

卵裂期胚胎評價為多個參數的綜合評價,主要參數為第3天胚胎卵裂球數目、碎片體積比例和不均卵裂球數目,我中心將2.5級以上胚胎定義為優質胚胎,其他級別為可用胚胎。在本實驗中我們根據評級將患者分為3組(優:1個或者2個優質胚胎;中:1個優質胚胎和1個可用胚胎;差:1個或者2個可用胚胎)。

囊胚期胚胎評價采用Garnder囊胚分級法。≥3BB定義為優質囊胚,其余為可用囊胚。同樣分為3組,即優:≥3BB;中:1個優質囊胚+1個可用囊胚或者3CB、4CB、5CB、6CB、3BC、4BC、5BC、6BC;差:2BB、2BC、2CB、2CC、3CC、4CC、5CC、6CC、早期囊胚。

1.5 觀察指標

受精率:2PN數/MⅡ卵子數;可用胚胎率:可用胚胎數/MⅡ卵子數;優胚率:優質胚胎數/MⅡ卵子數;可用囊胚形成率:囊胚形成數/囊胚培養數,囊胚形成數=移植的囊胚數+冷凍的囊胚數;妊娠率:臨床妊娠率=超聲可見孕囊及原始心管搏動/移植周期數×100%。妊娠判斷:臨床妊娠為孕5周B超下可見孕囊及胎心搏動[7]。

1.6 傾向評分匹配

為了避免兩組患者基線之間的差異而造成偏倚,用傾向評分匹配使得兩組的基線特征更加接近平衡。本研究采用1∶3比例進行匹配,匹配的相差范圍為0.01,匹配的條件為女方年齡、促排卵方案、移植的胚胎類型、胚胎質量、胚胎數量。共46個卵子激活組患者匹配到134個對照組人群(其中44個卵子激活組各匹配到3個對照組,2個卵子激活組各匹配到1個對照組),1個激活組患者沒有匹配到對照組。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 匹配前后兩組患者的一般資料比較

匹配前,卵子激活組女方年齡較小,成熟卵子數較多,差異有統計學意義(t值分別為2.72、-2.56,P<0.05),其他資料無統計學差異(P>0.05);匹配后,兩組間基線資料比較均無顯著性差異(P>0.05),具有可比性,見表1。

表1 兩組的基線特征比較

指標匹配前卵子激活組(n=47)對照組(n=327)χ2/tP匹配后卵子激活組(n=46)對照組(n=134)χ2/tP移植胚胎質量0.280.871.030.98 優22(46.81)140(42.81)21(45.65)61(45.52) 中9(19.15)65(19.88)9(19.57)28(20.90) 差16(34.04)122(37.31)16(34.78)45(33.58)移植胚胎類型1.790.180.320.44 胚胎35(74.47)270(82.57)35(76.09)109(81.34) 囊胚12(25.53)57(17.43)11(23.91)25(18.66)移植胚胎數1.520.471.450.66 116(34.04)93(28.44)15(32.61)39(29.10) 231(65.96)227(69.42)31(67.39)95(70.90)妊娠率29(61.70)181(55.35)-0.820.4129(63.04)77(57.46)0.640.51

2.2 兩組的實驗室和臨床結果比較

匹配前,兩組間在受精率、優質胚胎率、可用胚胎率和囊胚形成率之間無顯著性差異(P>0.05);匹配后,卵子激活組的可用胚胎率低于對照組(χ2=47.68,P<0.05),其余指標差別無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 兩組的實驗室和臨床結果比較 [n,n (%)]

2.3 多因素Logistic回歸分析卵子激活與臨床妊娠的關系

采用Logistic回歸模型評估卵子激活處理對臨床妊娠率的獨立作用,結果發現匹配后未調整模型、調整模型均無統計學差異,其OR值及95%CI分別為1.26(0.63～2.52)、1.55(0.67～3.56),P>0.05,見表3。

表3 多因素 Logistic回歸分析卵子激活與臨床妊娠的關系

3 討論

ICSI是挑選單個精子注射入卵母細胞完成受精的過程,對于男性不育的患者,包括少弱畸精子癥及梗阻性無精子癥,以及不明原因一代受精失敗的患者能夠得到與常規受精相同的臨床結局[1]。ICSI不僅可以使用射出精子,還可以利用睪丸中的精子完成受精。但是,與射出精子相比,睪丸精子的精子活力和精子成熟度存在不同程度的降低[2]。

3.1 人工卵子激活術對ICSI助孕臨床結局的影響

卵子激活是受精過程的關鍵步驟之一,是受精和胚胎發育的先決條件[3]。AOA能有效改善受精失敗或受精率低[8-12]及胚胎發育不良[13]的不孕夫婦的臨床結局,還可以顯著提高試管效率[5],提高每移植胚胎的活產率[14]。近年來關于人工卵子激活與臨床結局的研究很多,但是結果一直存在爭議。先前樣本量為21到194組患者的研究表明,人工卵子激活對臨床妊娠結局沒有影響[3,10,15-17]。而另有一些研究表明AOA可能對有精子相關的卵母細胞活化不足的不孕夫婦有幫助[9,11],我們的研究結果與O’Neill等[16]結果一致。我們發現與對照組(TESA+ICSI組)相比,TESA+ICSI+AOA組具有相同的臨床妊娠機會,這對于我們的臨床咨詢有一定的指導意義。

3.2 卵子激活術與實驗室結局的關系

本研究總共分析了374對夫婦采用睪丸取精術后行ICSI,其中47對夫婦實施了AOA,327對夫婦實施常規TESA+ICSI,并對兩組的受精數(率)、可用胚胎數(率)、優質胚胎數(率)及囊胚形成數(率)進行對比,發現匹配后卵子激活組的可用胚胎率顯著低于對照組,但對受精率是沒有改善的,說明卵子激活術對于新鮮睪丸精子ICSI后的受精率是沒有作用的。匹配后多因素回歸結果顯示AOA并不能改善患者的臨床妊娠結局。Bonte等[14]研究表明,AOA只是對有精子相關的卵母細胞活化不足的患者有效,而我們目前臨床上沒有開展這方面的診斷,只是對前次受精率低,或者胚胎發育差的這類患者進行卵子激活,但有可能這些人群并不是有卵子激活障礙的人群,可能并沒有達到真正的“對癥”治療,所以對受精的改善不明顯。

3.3 研究對象的選擇優勢

本次研究排除了所有一周期的患者,只納入了二周期及多周期的患者作為實驗組(卵子激活組)和對照組(常規TESA+ICSI組)。這是考慮臨床上AOA的治療原則:AOA組的患者都是多周期的,這樣設計比較嚴謹。同時,我們使用MⅡ卵母細胞的數量作為協變量,而不是收集的所有卵母細胞數量,因在ICSI周期中,成熟的卵母細胞數量是ICSI成功的關鍵因素,而不是獲得的卵母細胞數量。

盡管卵子激活在臨床上的應用越來越廣泛,但在其應用的適應證方面還需要進一步細化,或者未來能夠開展相關的診斷,使其能夠真正的“對癥”治療。卵子激活作為一項試驗性技術,仍然存在很多未知性,需要更加深入的觀察和多中心的大樣本研究。