氨氮對(duì)大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚急性毒性及生理變化的影響

唐忠林，張佳佳，周國勤，強(qiáng) 俊，徐 跑，徐鋼春，王佩佩，慶 輝

(1.南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214000)

目前，國內(nèi)養(yǎng)殖的大口黑鱸(Micropterussalmoides)主要包括優(yōu)鱸1號(hào)、優(yōu)鱸3號(hào)和未選育的普通鱸，同時(shí)研究表明，由于多代選育，國內(nèi)養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點(diǎn)比例和遺傳多樣性均有所下降[9]，這使得大口黑鱸種質(zhì)資源弱化，可能會(huì)引起病害等相關(guān)的養(yǎng)殖問題，因此有必要通過引進(jìn)其他遺傳多樣性高、遺傳改良潛力大的群體作為補(bǔ)充來改良我國大口黑鱸種質(zhì)。鑒于此，南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所聯(lián)合中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心2019年從美國引進(jìn)大口黑鱸北方亞種原種。有報(bào)道稱未進(jìn)行過選擇育種的加州原種可能存在遺傳瓶頸，易導(dǎo)致遺傳多樣性降低[9]，因此要對(duì)引進(jìn)種進(jìn)行選育，來保持遺傳多樣性的穩(wěn)定。在開展選育工作之前十分有必要了解加州原種子代對(duì)養(yǎng)殖水體環(huán)境的要求，以及對(duì)氨氮的耐受能力。因此，本試驗(yàn)通過探究在急性氨氮脅迫下大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代(簡稱“引進(jìn)種F1代”)一些生物指標(biāo)的變化，旨在綜合分析氨氮對(duì)該品種的毒理作用，為苗種生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚體質(zhì)量(12.51±0.91)g、體長(9.03±0.34)cm，是南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所自2019年從美國引入的北方亞種原種繁育所得。將實(shí)驗(yàn)用魚暫養(yǎng)于有生物過濾水再循環(huán)系統(tǒng)(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時(shí)間為14 h)的水族箱中。每天投喂兩次(8：00～9：00和20：00～21：00)江蘇南京帥豐飼料有限公司大口黑鱸配合飼料。整個(gè)暫養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間水中溶氧高于6.5 mg/L，氨氮與亞硝酸鹽低于0.01 mg/L，水溫為27 ℃，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，實(shí)驗(yàn)期間不投喂。

1.2 氨氮脅迫 96 h LC50 實(shí)驗(yàn)

采用96 h靜水式試驗(yàn)法對(duì)北方亞種引進(jìn)種F1代進(jìn)行氨氮毒性預(yù)試驗(yàn)。用干燥分析純晶體NH4Cl配制不同濃度的氨氮溶液，確定24 h未見死亡的最大氨氮濃度(20 mg/L)和全部死亡的最小氨氮濃度(40 mg/L)。

再根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果以等對(duì)數(shù)間距設(shè)置正式試驗(yàn)的7組氨氮濃度(0、20.98、23.71、26.79、30.27、34.21、38.65 mg/L)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每組放入20尾魚苗，分別記錄24、48、72和96 h死亡尾數(shù)，試驗(yàn)期間24 h換水一次，保持溶氧高于6 mg/L，pH為7.3，水溫為28 ℃。

1.3 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

依據(jù)氨氮脅迫96 h LC50，設(shè)置對(duì)照組(0 mg/L)與實(shí)驗(yàn)組(18 mg/L)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，選取體質(zhì)量相近、活性良好的幼魚60 尾隨機(jī)放置于3個(gè)養(yǎng)殖桶中(80 L)，每桶20尾。分別于脅迫后第0、6、12、24、48和 96 h在每個(gè)濃度組中隨機(jī)取樣。每次每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取2尾魚麻醉后解剖，迅速取出腦、鰓和肝組織置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 組織酶活性檢測

分別于脅迫后第0、6、12、24、48和 96 h在每個(gè)濃度組中隨機(jī)取3尾魚，取鰓組織0.1 g加入0.9 mL的生理鹽水，冰水浴勻漿，2 500 r/min 離心10 min取上清液，按照說明書測定蛋白濃度、Na+/K+-ATP酶。試劑盒均采自南京建成生物工程研究所。

1.5 組織RNA的提取與 cDNA的合成

組織RNA的提取采用高純總RNA快速抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP1202)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量(電壓120 V，電流165 mA，時(shí)間25 min)，用Nanodrop 檢測 RNA 的純度(OD260 nm/260)和濃度。根據(jù)HiScript?Reverse Transcriptase的說明(Vazyme，R123-01)進(jìn)行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.6 熒光定量PCR

參考陸健等[10]引物序列(詳見表1)。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)試劑盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95 ℃，10 s；58 ℃，60 s)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

非離子氨的計(jì)算公式如下：

NH3=TAN/[1+10(pKa-pH)]

pKa=0.090 18+2 729.92/T(T=273+t，T為開氏溫度，t為實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫)

安全質(zhì)量濃度(SC)=96 h LC50/10

通過SPSS 25.0軟件的分析—回歸—Probit分別計(jì)算得出24、48、72和96 h的LC50。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較檢驗(yàn)對(duì)同一時(shí)間不同濃度組間，以及同一濃度不同時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，用Origin 8.6繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚的急性毒性影響

氨氮對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚的急性毒性結(jié)果見表2。在相同的氨氮濃度下，幼魚死亡率隨氨氮脅迫時(shí)間的延長而升高；在相同的氨氮脅迫時(shí)間下，幼魚死亡率隨水體中氨氮濃度的升高而升高。經(jīng)96 h氨氮脅迫后，20.98 mg/L和23.71 mg/L兩組的死亡率低于50%，其余組的死亡率均高于50%，其中34.21 mg/L和38.65 mg/L組的試驗(yàn)魚全部死亡。

表2 不同氨氮濃度脅迫對(duì)大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚死亡率的影響Tab.2 Effects of different ammonia nitrogen concentrations on the mortality for the introduction of M.salmoides F1 juvenile

通過回歸分析得出引進(jìn)種F1代幼魚24、48、72、96 h的半致死濃度分別為33.66、29.86、26.98、25.08 mg/L；非離子氨半致死濃度分別為0.46、0.41、0.37和0.34 mg/L。氨氮安全濃度為2.51 mg/L，非離子氨的安全濃度是0.034 mg/L。

2.2 氨氮脅迫對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶活力的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，氨氮脅迫后鰓組織中Na+/K+-ATP酶呈先降低再升高的變化趨勢，脅迫12 h時(shí)達(dá)到最低值，且與對(duì)照組差異顯著。隨后開始上升，脅迫48 h時(shí)達(dá)到最高值，且與對(duì)照組差異顯著，為對(duì)照組的2.22倍。脅迫96 h時(shí)又恢復(fù)至對(duì)照組水平。

圖1 氨氮脅迫對(duì)大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶的影響Fig.1 Effects of ammonia-N stress on the Na+/K+-ATPase in gills for the introduction of M.salmoides F1 juvenile不同字母表示不同時(shí)間的數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)；*表示與對(duì)照組同一時(shí)間數(shù)據(jù)有顯著性差異(*：P<0.05，**：P<0.01)；后同此。

2.3 氨氮脅迫對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚hsp70基因表達(dá)的影響

由圖2和圖3可知，與對(duì)照組相比，氨氮脅迫后肝和鰓組織中hsp70 mRNA表達(dá)量均呈先升高再降低的變化趨勢，都在脅迫6 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的2.52和7.48倍，且與對(duì)照組差異顯著，隨后開始下降，肝組織hsp70 mRNA表達(dá)量在脅迫24 h時(shí)降至對(duì)照組水平；而鰓組織在脅迫24 h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組。48～96 h脅迫組肝和鰓組織hsp70 mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。由圖4可知，與對(duì)照組相比，氨氮脅迫后腦組織中hsp70 mRNA表達(dá)量在0 h時(shí)表達(dá)量最高，并隨著時(shí)間的延長持續(xù)下降，在脅迫6 h時(shí)就顯著低于對(duì)照組，直到脅迫24 h以后無顯著降低。

圖2 氨氮脅迫對(duì)大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚肝組織hsp70mRNA相對(duì)表達(dá)的影響Fig.2 The effects of ammonia-N stress on the relative expression of hsp70 mRNA in livers for introduction of M.salmoides F1 juvenile

圖3 氨氮脅迫對(duì)大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)的影響Fig.3 The effects of ammonia-N stress on the relative expression of hsp70 mRNA in gills for introduction of M.salmoides F1 juvenile

圖4 氨氮脅迫對(duì)大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚腦組織hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)的影響Fig.4 The effects of ammonia-N stress on relative expression of hsp70 mRNA in brains for introduction of M.salmoides F1 juvenile

3 討論

3.1 氨氮對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚的急性毒性影響

目前有關(guān)氨氮對(duì)水產(chǎn)魚類毒性作用的研究較多，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氨氮對(duì)大口黑鱸美國原種幼魚的急性毒性與氨氮濃度和脅迫時(shí)間呈線性關(guān)系，隨氨氮濃度提升幼魚死亡率急劇上升，死亡時(shí)間縮短，這與大多數(shù)魚類的結(jié)果一致[11-13]。在本試驗(yàn)條件(溶氧>6 mg/L，pH=7.3，水溫28 ℃)下，大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代對(duì)氨氮的安全濃度為2.51 mg/L，高于鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)幼魚(0.033 mg/L)[14]、鱖(Sinipercachuatsi)幼魚(0.013 mg/L)[12]、金魚(Carassiusauratus)(0.028 mg/L)[15]，低于草魚(Ctenopharyngodonidella)(0.096 mg/L)[16]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(0.327 mg/L)[17]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)(0.074 mg/L)[18]等大多數(shù)魚類，這表明種類不同的魚對(duì)氨氮耐受力有差異。同時(shí)，鄭洪武[19]的實(shí)驗(yàn)表明，在水溫 21 ℃、溶解氧 8.0 mg/L、pH 7.9的條件下，體質(zhì)量為20.02 g的大口黑鱸氨氮安全濃度為6.33 mg/L，高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是魚體大小不同，也可能是國內(nèi)養(yǎng)殖的大多數(shù)大口黑鱸經(jīng)過長期人工養(yǎng)殖馴化已能適應(yīng)肥沃水質(zhì)，其對(duì)氨氮的耐受力明顯增強(qiáng)，而大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代還未經(jīng)過馴化，暫不能適應(yīng)國內(nèi)養(yǎng)殖水體環(huán)境中較高的氨氮濃度[19]。這提示我們?cè)诖罂诤邝|引進(jìn)種的養(yǎng)殖馴化中要格外關(guān)注水體中氨氮含量。同時(shí)研究也表明，水體中氨氮毒性會(huì)受到水溫、pH、溶解氧和鹽度等因素的影響，本試驗(yàn)條件下，水體溫度的增加，水體中有毒的非離子氨所占的比例提高，導(dǎo)致水體氨氮毒性增強(qiáng)，魚體對(duì)氨氮的安全濃度降低[20-21]。這也提示廣大養(yǎng)殖戶在高密度養(yǎng)殖的過程中不僅要實(shí)時(shí)監(jiān)測水體中的氨氮濃度，還要及時(shí)監(jiān)測水體 pH，尤其在高溫天氣要及時(shí)采取換水降溫、調(diào)節(jié) pH 及曝氣等措施緊急緩解毒性，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

3.2 氨氮脅迫對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶活力的影響

3.3 氨氮脅迫對(duì)引進(jìn)種F1代幼魚hsp70基因表達(dá)的影響

熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是機(jī)體細(xì)胞受環(huán)境刺激誘導(dǎo)而產(chǎn)生的具有高度保守性的一組重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)性蛋白[27]。大量的研究表明HSPs家族基因廣泛參與魚類應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，當(dāng)暴露于環(huán)境應(yīng)激中，機(jī)體通過激活熱休克基因合成HSPs[28]。因此，HSPs被作為魚類養(yǎng)殖中檢測應(yīng)激程度、應(yīng)激能力的分子標(biāo)記[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫后大口黑鱸北方亞種F1代幼魚肝和鰓組織中hsp70基因的mRNA表達(dá)量均在6 h后呈現(xiàn)出顯著上升趨勢，且達(dá)到峰值，表明hsp70基因在氨氮脅迫時(shí)可以快速做出應(yīng)答，通過增加機(jī)體hsp70基因的表達(dá)水平從而減少H2O2對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷，以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[30]。孫麗穎等[31]對(duì)急性氨氮脅迫下黃顙魚幼魚HSPs基因表達(dá)變化的檢測中也獲得了類似的結(jié)果。同時(shí)，鄭洪武[19]和楊斯琪[32]用28.5 mg/L和38 mg/L濃度的氨氮脅迫普通大口黑鱸，各個(gè)組織中T-SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px活性在脅迫初期均有顯著升高，印證了氨氮脅迫后會(huì)激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)的自由基。但是，本試驗(yàn)中經(jīng)過氨氮脅迫大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚腦組織中hsp70基因的mRNA表達(dá)量于脅迫發(fā)生后均迅速降低，原因可能是大量的氨氮進(jìn)入體內(nèi)，導(dǎo)致谷氨酰胺在體內(nèi)過量積累，使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫大，引發(fā)腦水腫對(duì)腦組織造成了損傷[33]，影響到hsp70基因的轉(zhuǎn)錄。但隨著脅迫時(shí)間的延長，肝、腦、鰓組織中hsp70 mRNA表達(dá)量均呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是氨氮脅迫持續(xù)一定時(shí)間，對(duì)魚類的機(jī)體造成了氧化損傷和組織損傷，從而破壞了細(xì)胞的功能，致使hsp70修復(fù)受損DNA和蛋白的能力減弱，變性的蛋白在體內(nèi)累積，影響正常細(xì)胞的代謝能力[34]。同樣的，鄭洪武[19]的研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫7 d后，大口黑鱸的肝細(xì)胞大面積壞死，肝組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重；鰓絲毛細(xì)血管破碎，血細(xì)胞漫出，鰓腔內(nèi)充血嚴(yán)重，鰓小片結(jié)構(gòu)消失，這也充分說明機(jī)體對(duì)氨氮脅迫的調(diào)節(jié)是有限的。

4 結(jié)論

本研究初步表明，在溶氧>6 mg/L，pH=7.3，水溫28 ℃的試驗(yàn)條件下，大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚的氨氮安全濃度為2.51 mg/L。18 mg/L的氨氮脅迫會(huì)對(duì)其造成一定應(yīng)激損傷，在短時(shí)間內(nèi)可以進(jìn)行自我調(diào)節(jié)和修復(fù)，脅迫時(shí)間過長會(huì)造成機(jī)體的氧化損傷和組織損傷，表現(xiàn)在組織中hsp70mRNA 表達(dá)量低于對(duì)照組水平。