木薯FRK1類似基因的分離及表達分析

吳金山 陸小靜 王思琦 黃家權 張逸杰 賈迎雪 陳銀華

關鍵詞：木薯；FRK1類似基因；生物信息學；表達分析

果糖激酶（fructokinase，FRK）是植物細胞中果糖磷酸化的主要催化酶、變構酶和高效酶，其國際系統分類編號為EC2.7.1.4，是植物糖代謝的“控制閥”，在植物生長發育過程中主要調控植物的糖代謝、生長發育和響應生物/非生物脅迫等作用，是一種必不可少的不可逆酶[1]。目前，已有20多種植物分離鑒定出FRK基因[2]，如甜菜直根[3]、大豆[4]、馬鈴薯塊莖[5]、番茄果實[6-7]、豌豆、菠菜葉片、水稻、蘋果、玉米、百合花粉、毛果楊、枇杷[8]、大麥、甘蔗、鱷梨、山茶花粉[1，8]、棉花、谷子、高粱[8]、木薯[9]、北美云杉和蜜柑[10]等，但對其研究主要集中在果糖磷酸化及其基因表達方面，而在模式植物擬南芥中的研究相對較為深入。

FRK作為植物糖代謝過程中重要的碳通量調節激酶，其在植物逆境脅迫中發揮著重要作用。Z?RB等[11]通過對甘蔗基因組進行搜索鑒定，共發現7個FRK基因，在干旱脅迫誘導下，其基因家族中只有SsFRK3和SsFRK5兩個基因表達量呈顯著上升變化趨勢。在玉米中，短期的鹽脅迫可使FRK2基因的表達量上調；在向日葵植株中，利用干旱脅迫誘導，FRK基因表達呈上調趨勢，同時發現其幼苗葉片中FRK基因表達量上調了3.3倍，暗示FRK在干旱脅迫下發揮著重要作用[12]。目前有關FRK抗病分子機理研究在大豆、玉米、水稻、大麥等作物上有涉及[1]。

木薯（ManihotesculentaCrantz）為多年生灌木狀植物，因其塊根富含淀粉類物質，與馬鈴薯、甘薯一同被稱為世界三大薯類作物，是熱帶地區的重要口糧。其主要分布在我國南方的熱帶亞熱帶地區，如廣西、廣東、海南等省（區），其中廣西種植量最大，產量位居第一。木薯在種植過程中主要病害有8種，細菌性萎蔫?。–assavabacterialblight，CBB）是危害最為嚴重的病害之一，嚴重時可造成高達90%的產量損失[13]。目前CBB抗病分子機理還不清楚。在擬南芥中，FRK1是先天免疫下游標記基因，該基因的表達意味著病原相關分子模式觸發的免疫反應（PAMP-triggeredimmunity，PTI）途徑的啟動。因此，本研究以模式植物擬南芥為參照，采用同源序列法識別木薯FRK1類似基因并對其進行生物信息學及表達量分析，以期進一步推動木薯PTI相關研究，從而加快高產抗病木薯品種選育工作的步伐。

1材料與方法

1.1材料

以木薯SC8品種30d組培幼苗為材料，水培煉苗1周后進行處理，共設置3個處理，各處理分別為：①100μmol/L水楊酸（SA），②100μmol/L茉莉酸（JA），③黃單胞菌（Xam，OD600為0.6～0.8）。每個處理20株苗，3個重復。SA、JA利用噴霧的方式進行處理，Xam利用剪葉法接種進行處理，以無菌水作為對照。SA、JA處理后分別在0（CK）、15、30、60、120min取樣，病原菌Xam處理后分別在0（CK）、2、4、8d取樣，取樣部位均為植株葉片，每個樣品各取10片葉用錫箔紙包好后置于–80℃備用。

1.2方法

1.2.1木薯葉片總RNA的提取及cDNA合成取木薯葉片0.1g，速凍研磨，參照植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）說明書進行木薯葉片總RNA的提取。完成后迅速將總RNA溶解到30μL無酶無菌水中，加DNAⅠ消除總RNA中少量DNA，并用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA條帶的完整性及DNA的消除情況。取5μL總RNA反轉錄合成cDNA，具體實驗步驟參照RevertAidFirstStandcDNAsynthesis（Thermo）說明書進行。

1.2.2木薯FRK1類似基因的篩選在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protrin/）數據庫檢索得到擬南芥FRK1基因的相關信息（ORF序列和氨基酸序列），然后在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）網站上下載木薯全基因組等相關數據[14]。以擬南芥FRK1蛋白作為輸入序列，運用BLASTP軟件對木薯FRK類似基因進行搜索鑒定，e值設置為–10。

1.2.3木薯FRK基因生物信息學分析（1）木薯FRK基因家族同源性分析。運用ClustalW軟件對擬南芥FRK1氨基酸序列和木薯FRK氨基酸序列進行多序列聯配分析，序列比對結果通過軟件Mega7（http：//www.megasoftware.net/）的鄰接法（neighbor-joiningmethod，NJ）構建系統進化樹，Bootstrap值設為1000。

（2）木薯FRK類似基因的結構分析。木薯FRK基因的內含子和外顯子信息下載于Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）網站，使用在線網站GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因模式圖。

（3）木薯FRK類似基因的保守基序分析。利用蛋白質保守基序在線搜索程序MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）預測木薯FRK蛋白的保守基序，設置查找基序重復的數量為“any”。

（4）木薯FRK類似基因染色體定位分析。運用在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）網站上下載的木薯FRK類似基因信息制作染色體定位圖。

（5）木薯FRK上游基因共表達分析。使用在線網站STRING（http：//www.string-db.org/）的數據庫，得到擬南芥FRK1蛋白互作網絡圖。預測木薯FRK1蛋白的互作關系。

（6）木薯FRK基因響應逆境的表達值熱圖。在NCBI的SRA（sequencereadarchive）數據庫中下載Xam（Xanthomonasaxonopodispv.manihotis）細菌侵染木薯所得的3個轉錄組數據包[15]（SRR1050891、SRR1050892、SRR1050893）。參考文獻[16]的方法計算MeERF基因在生物脅迫處理下的RPKM值。用Mev（MultiExperimentViewe）軟件對數據進行處理，內置HCL程序進行層次聚類[16]。

1.2.4MeFRK1基因Real-timePCR表達分析利用Oligo7軟件對MeFRK1基因進行特異性引物設計，隨后利用一般PCR試驗檢驗其擴增特異性。使用在線網站NCBI的BLAST檢索確認設計的Real-timePCR引物的特異性。所用引物序列為MeFRK1-F：5-TTCGGTTCCTTTTGCTCTCG-3，MeFRK1-R：5-TGCCATGAGGATGACTACCAA-3。引物合成由華大基因科技服務有限公司完成。

Real-timePCR擴增程序為：95℃30s；95℃5s，55℃30s，72℃30s，25個循環；72℃延伸10min。結果采用2–△△CT的計算方法進行相對定量，以木薯EF1a基因作為內標校正模板量。每個樣品3個生物學重復。各激素處理時間點MeFRK1基因的表達水平與處理0min（處理前）相比。使用SigmaPlot軟件處理數據并制圖。

2結果與分析

2.1木薯FRK1同源基因分析

利用AtFRK1的蛋白序列進行搜索，共獲得8條木薯FRK類似基因，按照比對結果順序命名為MeFRK1～MeFRK8，具體信息見表1。在木薯基因組中，8個FRK類似基因氨基酸長度各不相同，位于804～921aa之間，其中最長的是MeFRK8，有921個氨基酸，最短的是MeFRK3，有804個氨基酸，蛋白質序列平均長度為863aa（表1）?；蛟谌旧w上的位置信息是研究基因家族進化和功能的重要證據。8個FRK類似基因在木薯染色體上呈不均勻分布，其中MeFRK1位于4號染色體上，MeFRK4、MeFRK5、MeFRK6、MeFRK7、MeFRK8均位于11號染色體上，而MeFRK2和MeFRK3位于核骨架Scaffold上（表1，圖1）。

2.2木薯FRK類似基因同源性及結構分析

由圖2可知，MeFRK1～MeFRK8和AtFRK1同源性分析可將其分為兩大類。第一大類主要有5個基因，分別為MeFRK2、MeFRK3、MeFRK4、MeFRK6、MeFRK8，屬于同一亞族[17]。其中MeFRK2和MeFRK6的同源性為99%，MeFRK8與組中各基因的同源性均較高，為100%。第二大類主要有4個基因，分別為AtFRK1、MeFRK1、MeFRK5和MeFRK7，其中MeFRK5和MeFRK7與AtFRK1的同源性為50%，為旁系同源性，MeFRK5和MeFRK7的同源性更近，為100%。通過對9個基因的同源性分析發現，8個木薯FRK類似基因與AtFRK1存在較高的同源性，同時木薯8個FRK類似基因間也存在較高的同源性。該基因家族中存在如此多的同源旁系基因，可能與木薯在適應不同的生長環境而進行有序的基因表達存在一定的關聯[18]。根據基因結構分析結果（圖3），也可將8個類似基因分為兩大類，其結果與進化樹結果一致。

2.3木薯FRK類似基因編碼蛋白保守基序分析

通過保守基序預測發現，8個MeFRK蛋白與AtFRK蛋白均存在3個相同保守基序Motif1、Motif2和Motif3（圖4），基序長度位于50～250aa之間（表2）。其中，Motif1為酪氨酸蛋白激酶（proteintyrosinekinase，PTK）結構域，能催化多種底物蛋白質酪氨酸殘基磷酸化，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。Motif2為內質網碳水化合物結合蛋白（carbohydrate-bindingproteinoftheER）結構域。Motif3為富含亮氨酸重復（leucinerichrepea，LRR）結構域，參與蛋白質的相互作用，是已知抗病蛋白的重要結構。

綜上，8個MeFRK蛋白可能均參與蛋白質間的相互作用。其中，MeFRK1與AtFRK1的同源性最近，為旁系同源性。因此初步篩選MeFRK1基因為木薯基因組中先天免疫下游標記基因。

2.4木薯FRK基因上游基因共表達分析

由圖5和表3可知，預測MeFRK1蛋白與10個蛋白存在互作關系，其中8種與2C型蛋白磷酸酶（proteinphosphatase2c，PP2C）相關，WRKY6也涉及其中。PP2C基因在脫落酸（abscisicacid，ABA）、茉莉酸（jasmonicacid，MeJA）以及水楊酸（salicylicacid，SA）等激素信號轉導途徑中發揮著重要作用，參與調節木薯在高滲、干旱以及低鹽等逆境中的生存能力[19-20]。由此可推測，FRK1基因也可能參與木薯的生長發育，是木薯應對不同逆境潛在信號因子之一。另有研究顯示，WRKY轉錄因子家族廣泛參與植物的生長發育、代謝調控、生物脅迫與非生物脅迫應答等過程，是植物免疫系統中許多信號通路的核心組成部分，如PTI基礎防御以及ETI系統獲得性抗性，對于木薯抗病性的研究具有重要的指導意義[21]；而WRKY6在木薯響應生物脅迫時呈正調控作用，進而推測FRK基因家族也參與木薯生物脅迫應答過程。

2.5木薯FRK基因響應逆境的表達值熱圖

通過對各基因接菌Xam前后葉片表達量變化趨勢分析發現，隨著時間的推移，MeFRK1和MeFRK3的表達量呈不斷上調的變化趨勢，但MeFRK1的變化趨勢更明顯；MeFRK2、MeFRK4、MeFRK6三個基因表達量呈先下調后上調且表達水平接近；而MeFRK8表達量呈先上調后下調的變化趨勢，MeFRK7不斷下調，但MeFRK5一直維持在一個相對較穩定的水平（圖6）。

2.6不同處理葉片中MeFRK1基因表達量測定

利用Real-timePCR法測定SC8組培幼苗葉片MeFRK1基因在SA、JA和病原菌Xam三種處理下的瞬時表達量[22]，結果發現，其在3種處理下基本均呈先上升后下降的變化趨勢（圖7）。在激素SA、JA處理后15min時二者達到最大值，而在病原菌Xam處理后第4天時達到最大值，其表達量是激素SA處理時最大值的2.84倍，是JA處理后的3.06倍。由此可以說明，病原菌Xam脅迫更能誘導MeFRK基因的表達，有助于提高木薯對病原菌Xam的抗性。本研究通過對木薯MeFRK1基因瞬時表達的研究，為分離鑒定木薯PTI途徑下游的標記基因，研究木薯抗病分子機理有著重要的意義。

3討論

木薯因富含淀粉被譽為“淀粉之王”“地下糧倉”等[23]。而FRK是植物中糖代謝的關鍵酶，因此研究FRK對木薯淀粉的儲藏、改善食用風味，提高抗病能力等有著重要的作用。研究發現，植物中果糖可作為信號分子直接或通過與其他信號通路交叉調節基因的表達，在植物遭受逆境脅迫中發揮重要作用[24]。近年來，隨著生物信息學技術普遍應用及基因組學、蛋白組學的研究快速發展，有更多潛在的FRK基因在多種植物中被挖掘。如FRK1在番茄整株植株中均有表達，FRK2具有庫特異性，而在源器官中表達很低[6]。FRK在缺氧條件下對水稻幼苗碳水化合物代謝發揮著重要作用，在轉錄水平上，OsFRK1優先在有氧條件下表達，而OsFRK2需要在缺氧條件下表達[2]。

目前，有關木薯中FRK基因的抗病性還不清楚。本研究基于擬南芥先天免疫下游標記基因FRK1，通過搜索從木薯基因組中篩選出8個類似基因。隨后利用生物信息學中的軟件對其進行同源性、在染色體中的位置、蛋白結構以及蛋白質間的相互作用等進行分析。結果發現，MeFRK1、MeFRK5和MeFRK7三個基因與AtFRK1親緣關系最近，基因相似度最高，由此推斷，此4個基因在起源上存在一定的相關性。通過染色體定位發現，8個FRK類似基因在木薯染色體上呈不均勻分布，可能分別在木薯生長發育過程中承擔不同的功能。在8個基因中只有MeFRK1位于4號染色體，與AtFRK1屬于旁系同源，其余5個位于11號染色體上，其結果與雙子葉植物擬南芥等的FRK家族成員在染色體定位基本一致[1]。通過保守基序分析發現，9個蛋白存在3個相同的保守基序，長度位于50～250aa間，且基序的次序和間隔長度比較保守。該家族基因編碼蛋白基序的保守性暗示在木薯中不同的FRK蛋白可能存在功能冗余現象。同時對3個保守基序功能進行分析發現，Motif3參與了蛋白質間的相互作用，是已知抗病蛋白的重要結構[25]。木薯FRK1類似基因不僅與擬南芥FRK1基因親緣關系較近，基因結構相似，且二者的功能也類似。由此初步篩選MeFRK1為木薯基因組免疫下游標記基因。

激素是植物對生物非生物脅迫反應的調節劑，參與各種復雜的信號轉導通路，以此調節不同的應激反應。水楊酸（SA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）4種激素主要調節植物對病原體的防御[26]。當用激素處理植物后，其PRRs識別PAMPs分子，短時間內植物做出的應答反應就包括啟動水楊酸、茉莉酸信號傳導途徑[27]?；虮磉_模式分析在一定程度可推測基因的分子功能，有利于對該基因功能的研究。本研究通過SA、JA的噴施、黃單胞菌（Xam）的侵染3種方法分別處理木薯葉片，通過分析處理后木薯葉片中FRK1基因在不同時間的表達量變化。結果發現，MeFRK1基因的表達量在3種處理下呈差異性表達，表明此基因可能是木薯生物逆境脅迫系統中的關鍵標記因子。在SA處理后，MeFRK1的表達量在15min時達到最高值，其余時間均表現為下調。同樣，在JA處理后，15min時表達量也遠高于對照組，是對照組的1.5倍以上，隨之下降，在60min和120min的表達量接近于零。說明此基因在響應SA和JA信號途徑時，短時間內具有正調控作用，且反應較為迅速。在響應生物脅迫時，3個時間的相對表達量均高于對照組，在第4天時達到最高值，接近對照的5倍。由此說明，此基因對于病原相關分子機制能夠做出快速響應，暗示其可能與抗病途徑有關。

植物在生長發育過程中，經過長期對逆境的適應，自身也產生一些免疫防御機制，通過上調或下調某個或某些基因的表達量來調控逆境有關信號通路以適應環境的變化[16]。而植物細胞中的糖類物質可在FRK作用下通過活化免疫反應參與植物防衛過程，在病原菌等生物脅迫中發揮重要作用[28]。木薯是熱帶地區重要的糧食及能源物質，其在生長發育過程中面臨著病蟲害等多種生物非生物的脅迫，嚴重影響了木薯的產量和品質。因此，提高木薯抵抗逆境脅迫的能力至關重要。本研究通過對木薯FRK類似基因進行篩選分析，并在3種處理情況下驗證其瞬時表達量，其結果可為后期驗證木薯FRK基因的功能、研究其相關信號通路及抗病調控機理提供參考。