流式細胞儀檢測香花油茶、越南油茶基因組大小方法的建立及應用

吳方圓 蔡婭 郝丙青 賈艷霞 葉航 張照遠 馬錦林

關鍵詞：油茶；基因組大小；流式細胞儀

油茶（Camelliaoleifera）是世界四大木本食用油料植物、我國四大木本油料植物、我國最重要的食用油料樹種。經濟價值高、用途廣、綜合開發范圍廣、利用潛力大，被農戶稱為“鐵桿莊稼”“綠色油庫”。發展油茶產業，對于緩解我國耕地資源剛性不足，保障食用植物油供給安全，優化食用植物油結構，促進國民健康和推進丘陵山區農民精準扶貧等都具有非常重要的意義。油茶產業受到國家和各級地方政府的高度重視，正處于快速發展期。2022年中央一號文件中明確提出“支持擴大油茶種植面積，改造提升低產林”。作為我國油茶三大主產區的廣西，油茶是廣西九大農業產業和五大林業優勢產業之一，是長期鞏固精準脫貧成效的壓艙石。廣西實施千萬畝油茶、千億元產業的“雙千計劃”，根據廣西壯族自治區林業局統計資料，截至2021年底，全區油茶種植面積達57.07萬hm2。

廣西長期以來以普通油茶岑軟2號、岑軟3號等品種為主，種植品種較為單一。廣西擁有豐富的油茶特色種質資源[1]，其中香花油茶和越南油茶是廣西地區今后大力發展的油茶物種。廣西壯族自治區林業科學研究院自2005年開始香花油茶選育的研究，獲得160多份優良種質。近年來香花油茶生長快、適應性抗逆性強、結果多等優良特性得到廣大種植戶、企事業單位的認可，正在大力推廣中。越南油茶是南亞熱帶分布的重要物種，研究相對薄弱，經過十多年的研究獲得30多份優良種質，其大果特性適合應對今后勞動力短缺價格昂貴、摘果費時費力等生產實際問題。目前這些優良品系均保存在廣西國家油茶種質資源庫中，圍繞這些種質已開展新品種良種審（認）定工作，截至2022年9月，獲得香花油茶新品種10個、良種6個，越南油茶新品種3個；已開展雜交育種、家系繁育工作，已開展植物學性狀、經濟性狀及少量分子標記等方面多樣性研究，但關于基因組大小遺傳多樣性方面的研究尚未開展。檢測其基因組大小，為今后基因組測序模式種質篩選提供方便，為今后分子研究提供鋪墊，有助于初步推測其倍性及物種間自然雜交可能性，為今后多倍體授粉可配性研究、多倍體種質創制提供基礎，以減少育種的工作量及盲目性。開展基因組大小多樣性方面的研究，有助于克服環境帶來的表型差異影響，從遺傳物質的角度更深一步篩選特異種質。

應用流式細胞術測定薔薇、茉莉花、山竹、甘蔗、火龍果、葡萄、棗、蘿芙木、橡膠、柳樹、桑樹、茶樹等植物構建的流式細胞術基因組大小檢測技術體系均不盡相同[2-5]。龔倩穎[6]針對海南油茶分別以根、葉片、花瓣3個部位的材料進行流式細胞術試驗，結果發現，以花瓣為材料獲得的效果最好，嫩葉次之，以扦插苗的根為材料很難得到理想的結果，以成熟葉片為材料在加入染色劑后出現嚴重褐化現象，容易堵塞儀器，致使試驗無法進行；楊曉蘭等[7]針對江西15個油茶品種用水稻（389Mb）為內標，從常規Gal、WPB、Tris-MgCl2、OTTO等4種解離液中篩選出適合油茶的流式細胞術的解離液為改良的OTTO。由于試材種類狀態、試驗平臺條件、試驗人員技術操作水平與測定結果準確性要求程度等方面的不同，各地科技人員都在因地制宜構建適合的流式細胞術基因組大小檢測技術體系。

基因組大小是指生物體的單倍體基因組所含的DNA含量[8]。流式細胞術可以用來測定植物DNA的絕對含量，是近年發展起來的測定方法，通過比較熒光強度，從而計算出待測樣品DNA含量。該方法不受植物體取材部位和細胞所處時期限制，取材部位可以是葉片、莖、根、花、果皮、種子等。特別是在離體培養過程中，植株或芽很小和很嫩時，此方法僅用1cm2的樣品就很容易決定其材料倍性。該方法簡便快速易行，檢測結果較為準確穩定可靠[9]。流式細胞術也存在一定的缺陷，流式細胞儀設備較昂貴，并且維護人員需較高的專業水平進行復雜的儀器操作和樣品前處理，限制了其在植物領域中的應用。其原理為：有絲分裂中期細胞去細胞壁后制成特異性熒光染色的核懸浮液，作為樣品加入到流式細胞儀并形成狹窄的液流高速通過光學檢測系統的高強度光束，已染色的染色體產生的熒光被量化，進而根據相對熒光強度經儀器附設計算機自動統計，根據統計結果計算DNA含量[10]。碘化丙啶是一種熒光染料，能均勻嵌入到雙鏈核酸堿基對中，因此可以對DNA進行特異性染色[11]。在488nm激發光下，碘化丙啶發出的熒光可被流式細胞儀檢測。并且碘化丙啶在著色過程中的嵌入量與DNA量呈正比關系，故熒光強度可以表示出基因組DNA的相對含量[12]。觀察待測樣品和內參碘化丙啶-DNA復合體的熒光峰值，即可得出2種植物DNA含量的比值，再乘以內參植物的基因組大小，即可計算出待測植物的基因組大小。即計算公式：待測樣品DNA含量=內參DNA含量×待測樣品的熒光強度/內參樣品的熒光強度[13]。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料選用香花油茶良種義祿及越南油茶優良品系鴻鴣23，組織部位選擇嫩葉、成葉、根尖組織進行試驗。內參植物為番茄（0.92Gb）、玉米（2.30Gb）、豌豆（4.45Gb），以種子萌發后1個月的嫩葉為試驗材料，其種子取自中國科學院昆明植物研究所。

1.2方法

1.2.1基于香花油茶、越南油茶為試材的流式細胞術基因組大小檢測技術體系構建針對檢測中的關鍵環節，分別研究解離液種類、內參植物、試驗材料組織部位對檢測效果的影響，每個處理重復3次。選取4種常見的解離液WPB、Tris-MgCl2、OTTO、mGb，具體配方見表1。

1.2.2香花油茶、越南油茶優良品系基因組大小檢測基于香花油茶、越南油茶為試材構建的流式細胞術基因組大小檢測技術體系：解離液為改良后的mGb解離液；內參植物豌豆為優先，若出現重峰時，以玉米為內參；試驗材料組織部位為嫩葉。采用以上技術體系，以香花油茶、越南油茶優良品系為試材，檢測其基因組大小。

（1）細胞懸浮液制備。將樣品置于0.8mL預冷的mGb解離液中，用鋒利的刀片將組織迅速垂直切碎，使其在解離液中冰上靜置10min，將制備好的細胞核懸液用300目尼龍網過濾至5mL聚苯乙烯無帽圓底未滅菌流式管，即得到細胞核懸浮液。

（2）DNA特異性染色。在細胞核懸液加入預冷的碘化丙啶和RNAase溶液，置于冰上避光染色0.5～1.0h。碘化丙啶染液和RNAase溶液的工作濃度均為50μg/mL。

（3）流式細胞儀檢測。以豌豆為內參（當出現重峰時，內參替換為玉米），將待測樣品的懸液和內參樣品的懸液混合。利用美國BectonDickinson公司生產的FACScalibur流式細胞儀對染色后的細胞核懸浮液樣品上機檢測，設置參數碘化丙啶激發波長為488nm藍光，上機后收集通道FL2的熒光、檢測碘化丙啶發射的熒光強度，每次檢測收集10000個顆粒。收集數據使用Modifit3.0分析軟件作圖分析，變異系數控制在5%以內。

（4）基因組大小計算。根據公式：待測樣品DNA含量=內參DNA含量×待測樣品的熒光強度/內參樣品的熒光強度，計算待測樣品的基因組大小值。

2結果與分析

2.1基于香花油茶、越南油茶為試材的流式細胞術基因組大小檢測技術體系構建

2.1.1不同解離液對出峰的影響流式細胞儀之所以可以準確檢測植株倍性的關鍵是用適宜的細胞核解離液制備擁有單個的、完整的細胞核懸浮液[14]。目前雖然有多種提取細胞核的解離液，但不同植株因遺傳基礎不同，導致在組織和結構成分、含量等方面均有差異，因此降解各種成分所需的化學物質含量也不同，至今還未發現適合于所有物種的通用提取液[15]。

為篩選適用于香花油茶、越南油茶基因組大小測定的最佳解離液，選取香花油茶和越南油茶的幼嫩葉片為試材，應用6種常用解離液來解離細胞核。如圖1所示，WPB和mGb這2種解離液主峰清晰、主雜峰分離程度高且mGb解離液的效果最佳。但是，由于標準的mGb解離液中加入了高濃度的β-巰基乙醇，而β-巰基乙醇對人體的呼吸系統有強烈刺激并有接觸性毒性，二硫蘇糖醇和巰基乙醇相比，作用相似，但二硫蘇糖醇的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。β-巰基乙醇作為還原劑的主要作用是保護染色質蛋白，消除酚類化合物對DNA染色的影響。發現去掉二硫蘇糖醇替代標準mGb中的β-巰基乙醇并不影響細胞核解離效果，因此在后期實驗中均選擇改良后的mGb解離液。

2.1.2不同內參對待測植物基因組大小的影響

目前雖然有研究證明許多組織可用于流式細胞儀檢測，但是相比其他材料，葉片組織不僅可以產生較好的試驗效果，而且取材容易、成本較低、耗時短，因此在流式細胞儀選材中，葉片被廣泛使用。本研究中選用成葉為材料，以番茄、玉米、豌豆3種植物作為內參。

內參應滿足以下3個條件：（1）內參DNA含量同待測樣品DNA含量相近，從而降低儀器非線性引起的誤差風險，減少零位偏移；（2）參照樣本峰不能與目標樣本峰重疊，最好也不能與目標樣本的G2或M期峰值重疊[15]；（3）內參植物的DNA含量均已知且穩定。從圖2可以看出，以此3種植物為內參也均未出現重峰現象，獲得較好的細胞峰出峰效果，但是相較而言豌豆同目標樣本的DNA含量最為相近。

由表2可知，以玉米和豌豆為內參計算的樣品基因組大小接近，在誤差范圍內，說明這2種內參均比較合適。但是以番茄為內參的測定結果顯著小于其他2種內參的測定結果，可能是因為番茄的基因組與待測樣品的基因組大小相差較遠，所以造成的誤差更大。因此在后續試驗中選擇以豌豆為內參來計算其他待測植物的基因組大小。

2.1.3不同組織部位對待測植物基因組大小的影響流式細胞儀對植物材料也有嚴格要求，選取的材料太老或者太嫩時，會影響峰值的形成。材料的選擇是用流式細胞儀測定基因組大小成功的首要因素。在本研究中分別使用植株的嫩葉、成葉和根尖來驗證不同組織器官對基因組大小檢測結果準確性的影響。從圖3可以看出，以主峰清晰程度、主雜峰分離程度、細胞碎片多少等方面綜合考慮，無論是香花油茶還是越南油茶，細胞峰出峰效果：嫩葉優于根尖優于成葉。

由表3可知，所選用的3種植物材料中嫩葉的變異系數均小于5，而成葉和根尖的變異系數大于5，說明嫩葉效果最佳；另外，發現成葉中的基因組大小顯著小于嫩葉和根；香花油茶嫩葉和根尖的檢測結果接近，而越南油茶根尖測定結果顯著大于葉片。在后續試驗中選擇以嫩葉為材料來開展流式細胞術試驗。

2.2香花油茶、越南油茶優良品系基因組大小檢測

采用基于香花油茶良種義祿、越南油茶優良品系鴻鴣23為試材構建的流式細胞術基因組大小檢測技術體系測定香花油茶、越南油茶優良品系山茶屬植物基因組大小時，其細胞峰出峰穩定情況、峰形、CV值等均較好，但在測定表4中香花油茶1號、45號優良品系，由于待測樣品與內參基因組大小接近出現重峰的情況，因此將內參替換為玉米。

由表4可知，1～45號來自于香花油茶優良品系，基因組大小在5.12～9.31Gb之間變化，均值為7.60Gb。1～38號來自于香花油茶優樹選育，其中1～36號及38號基因組大小在7.07～8.56Gb之間變化，均值為7.72Gb，1號基因組大小為5.12Gb，明顯低于其他品系基因組大小；37號基因組大小為9.31Gb，明顯高于其他品系基因組大小。39～45號均來自于香花油茶優樹家系，其中39～44號基因組大小在6.32～8.94Gb之間變化，均值為7.66Gb，45號基因組大小為5.14Gb，明顯低于其他品系基因組大小。46～51號來自于越南油茶優樹選育，其基因組大小在9.17～9.85Gb之間變化，均值為9.47Gb，與絕大多數的香花油茶優良品系相比，在基因組大小上存在數量級的明顯差異。1號、37號、45號種質在基因組大小分布上存在極端性，日常觀察中發現1號、37號、45號品系在種質長勢形態上存在明顯的特異性，由此可推斷其長勢形態上的差異并非是環境的影響而是遺傳基礎不同造成的，推測其存在倍性差異或其親本間存在種間雜交。

3結論與討論

以香花油茶、越南油茶為研究對象，針對檢測中的關鍵環節，分別研究解離液種類、內參植物、試驗材料組織部位對檢測效果的影響，以細胞核解離情況、次生代謝物質降解情況、細胞峰出峰穩定情況、主峰清晰程度、主雜峰分離程度、取材容易程度、內參與待測樣品基因組大小差異情況、基因組大小測定準確性及變異系數等方面為評價指標，研究發現4種常見的解離液WPB、Tris-MgCl2、OTTO、mGb中WPB、mGb解離效果較好，內參植物以豌豆或玉米為佳，試驗材料組織部位以嫩葉或者根尖為宜。綜合各方面情況，最佳體系參數設置為：解離液為改良后的mGb解離液；內參植物豌豆為優先，若出現重峰時，以玉米為內參；試驗材料組織部位為嫩葉。香花油茶優良品系基因組大小在5.12～9.31Gb之間變化，均值為7.60Gb，1號、37號、45號種質在基因組大小分布上存在極端性，推測其存在倍性差異或其親本間存在種間雜交；越南油茶優良品系基因組大小在9.17～9.85Gb之間變化，均值為9.47Gb。香花油茶與越南油茶優良品系群體間在基因組大小上存在明顯差異，推測其物種間存在倍性差異。

在基因組大小體系構建摸索過程中發現，任何一個關鍵環節的改變，都可能會造成流式細胞術測定基因組大小的改變，比如無論是香花油茶義祿還是越南油茶鴻鴣23，均以成葉為試材，以改良后的mGb溶液為解離液，選用不同內參得到的基因組大小存在差異。任何一個小環節的改變，都可能會造成基因組大小的輕微改變。比如在內參也相同的情況下，選擇不同成熟度的成葉也會造成基因組大小檢測結果的不同。在取材時選擇相同成熟度的成葉，但材料來源于母樹還是后期繁育的無性系幼苗，也會造成差異。離體保存不同時間下的測定結果也不盡相同。其造成差異的原因來自于多方面，有可能是因為自身攜帶次生代謝物質差異造成，也有可能是自身材料狀態差異造成，也有可能是細胞群人為選取范圍主觀性差異。因此種質間基因組大小未產生明顯差異時，二者應盡可能置于同等的流式細胞術基因組大小檢測技術體系下方可比較基因組大小。由此可說明，本研究中優良品系間基因組大小具有可比性。

但值得慶幸的是，在關鍵環節等同的條件下大多數測定基因組大小變化不大，而流式細胞術只是用于估測基因組大小的大概值，微小的差異對測定結果的應用意義影響較小。要想準確得知一份種質的基因組大小，還是需要測序技術才得以實現。然而基因組測序費用昂貴，在油茶方面應用技術并不成熟，不適宜針對每一份種質開展。