綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61基因克隆及表達分析

向南星 李澤鳳 李新藝 魏春梅 黃美娟 黃海泉

關鍵詞：綠萼鳳仙花；滇水金鳳；MYB61；木質素；表達分析

在低等植物向高等植物進化過程中，植物木質化是適應陸地環境的關鍵表現之一[1]；木質化是指木質素單體氧化聚合形成的木質素在細胞壁上沉積，使植物細胞壁增厚的過程[2]；木質素的沉積過程一般發生在次生木質部，具有增強植物的機械支撐力、保障植物體內的營養物質長距離運輸及提高生物及非生物脅迫能力等功能[3-6]。近年來，隨著分子生物學、基因組學和蛋白組學等方面的發展，植物木質化的分子調控機制已得到深入的研究。木質素作為植物生長發育過程中的一種次生代謝產物，其合成受轉錄因子和激素酶等制約；其中MYB、NAC和WRKY類轉錄因子家族主要參與調控木質素生物合成和其他次級細胞壁形成的相關途徑[7-8]；尤以MYB類轉錄因子在此過程中發揮直接且重要的調控作用。

MYB家族作為植物中最大轉錄因子家族之一，其主要調節植物的生長發育過程，如代謝調節、生物和非生物的應激響應、細胞分裂和細胞周期的控制等[9]。MYB家族基因均含有一段高度保守的MYB結構域[10]；根據MYB結構域的數量和基序重復類型及個數不同，將其分成1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[11]。研究表明，R2R3-MYB廣泛參與苯丙烷類代謝途徑，如調控木質素的生物合成、次生代謝和細胞分裂等方面[12]。研究發現源自擬南芥的AtMYB61屬于R2R3-MYB類轉錄因子，主要參與調控植物木質部木質化和氣孔孔徑等方面[13-15]；源自神農香菊的CiMYB61基因在煙草中過表達時，發現轉基因煙草的莖和葉中的木質素含量顯著增加[16]；在擬南芥中過表達AtMYB61會使木質素異位沉積[13-14]；且MYB61是調控水稻細胞壁中纖維素合成的顯性因子之一[17-18]；綜上，MYB61基因參與調控了植物木質素的生物合成。

我國鳳仙花屬（ImpatiensL.）植物資源極為豐富，約有270余種，且主要分布于中國西南地區[19]；根據鳳仙花對水分的依賴程度，主要分為水生、濕生和陸生三大類型，且不同類型鳳仙花的木質化程度存在較大差異[20]。綠萼鳳仙花（Impatienschlorosepala）和滇水金鳳（Impatiensuliginosa）主要分布在云南省和貴州省，因花型獨特、分枝能力強和花期長等特點，可作為園林植物予以開發利用[21]；綠萼鳳仙花生長于山谷溪水或疏林旁，其莖匍匐肉質且含水量大，屬于典型的濕生鳳仙花；滇水金鳳主要在水中生長，其莖直立且空心，易倒伏，屬于典型的水生鳳仙花。滇水金鳳和綠萼鳳仙花木質化的研究不僅能對該屬植物從水生到陸生的適應機制作出相應判斷，還有助于培育更健壯的鳳仙花植株。目前，尚無滇水金鳳和綠萼鳳仙花木質素相關基因MYB61的報道。本研究以綠萼鳳仙花和滇水金鳳為試驗材料，分離克隆MYB61基因，并對其序列進行生物信息學及系統發育分析；采用qRT-PCR闡釋其在這2種鳳仙花的3個不同部位2個時期的時空表達模式，結合木質素總含量的測定結果，進而探討MYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳木質素生物合成中的功能與作用，為后期進一步探究不同鳳仙花木質化差異及新品種培育提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為綠萼鳳仙花和滇水金鳳，綠萼鳳仙花種植于西南林業大學的樹木園中，滇水金鳳采摘于昆明市撈魚河公園。采取這2種鳳仙花幼苗期和成熟期地下5cm處的根、距頂端的第5片葉和地上5cm處的莖桿。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取與MYB61基因的克隆按照RNA提取試劑盒（OMEGA）操作步驟提取綠萼鳳仙花和滇水金鳳莖的總RNA；再使用逆轉錄試劑盒（全式金）將RNA合成cDNA，并將其置于–20℃冰箱備用。利用本課題組的轉錄組數據設計引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用cDNA模板和引物對MYB61基因進行PCR擴增，其體系為50.0μL。PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性50s，58℃（IuMYB61）/59℃（IcMYB61）退火1min，72℃延伸1min，36個循環；72℃延伸10min；PCR產物回收純化后連接到pMD19-T載體，并轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性菌液交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2MYB61基因的生物信息學分析IcMYB61和IuMYB61基因的理化性質通過ExPASy在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）進行分析；利用SMART在線軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/opennewwindow）對其結構域進行分析預測，再使用CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對它們的超級家族進行預測。通過NCBI數據庫Blast工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找同源性高的序列，再用DNAMAN9.0軟件完成序列的多重比對及同源性分析；在MEGA-X軟件上構建系統發育樹。

1.2.3MYB61基因的表達特性分析提取綠萼鳳仙花和滇水金鳳在幼苗期和成熟期根、莖和葉的總RNA，逆轉錄合成cDNA。通過Primerdesigningtool.nih.gov網站設計IcMYB61基因的熒光定量引物（表2）。參照丁愛琴等[22]的內參基因的2–ΔΔCT法，對每個部位進行3次生物重復，將根作為對照，計算出MYB61基因在2個不同時期綠萼鳳仙花和滇水金鳳的3個不同部位中的相對表達量，利用SPSSStatistics25軟件對得到的相對表達量數據進行顯著性分析，再使用Origin2021軟件對分析結果作直觀視圖。

1.2.4木質素含量的測定將成熟期綠萼鳳仙花和滇水金鳳整株的新鮮的莖和葉在60℃下烘干至恒重，每個樣品3次重復，詳細步驟參照胡慧貞[23]的木質素含量測定方法，得到木質素酸溶和酸不溶的總含量，使用SPSS軟件進行數據分析。

2結果與分析

2.1MYB61基因的克隆

以綠萼鳳仙花和滇水金鳳的cDNA為模板，經RT-PCR擴增后得到目的片段（圖1），將結果序列與轉錄組數據比對發現，序列一致，分別將其命名為IcMYB61（登錄號：OP490310）和IuMYB61（登錄號：OP490311）；將其cDNA序列與gDNA序列全長比對發現，IcMYB61和IuMYB61基因均由2個外顯子和1個內含子構成，均在上游，其內含子長度分別為84bp和66bp（圖2）。

2.2MYB61基因的理化性質分析

利用ExPasy-ProtParam在線軟件對綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61基因進行分析（表3），IcMYB61和IuMYB61全長分別為1035bp和1002bp，分別編碼344aa和333aa；不穩定指數分別為67.67和65.89，其數值高于40，故IcMYB61和IuMYB61均為不穩定蛋白；總平均親水指數分別為–0.728和–0.716，其數值均低于0，推測IcMYB61和IuMYB61為親水性蛋白。

2.3MYB61基因的結構域及系統進化分析

綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61基因的結構域與保守域預測結果表明，IcMYB61和IuMYB61基因的2個典型SANT保守結構域均在13～63和66～114位氨基酸之間（圖3）。通過DNAMAN9.0軟件對試驗的IcMYB61和IuMYB61與其他物種MYB61基因進行氨基酸同源序列比對分析（圖4），結果發現，IcMYB61和IuMYB61基因與其他植物的氨基酸序列的一致性為56.7%，且同源性主要在N端較高，C端的一致性較低，說明綠萼鳳仙花、滇水金鳳和其他物種的MYB61基因在C端的差異均較大。

利用MEGA-X軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ），根據綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61及其他MYB61同源物種的氨基酸序列，從1000個重復中推導出bootstrap共識樹，并構建IcMYB61和IuMYB61基因與其他MYB61基因同源物種的系統發育分析樹，從圖5可以看出IcMYB61和IuMYB61基因與喜馬拉雅鳳仙花MYB61基因聚為一個大支，IuMYB61基因與喜馬拉雅鳳仙花（ImpatiensglanduliferaXP047337748.1）的同源性較IcMYB61更高，說明IuMYB61與喜馬拉雅鳳仙花的親緣關系更近，在一定程度上可以證明同一個屬的親緣關系更近。

2.4MYB61基因的表達分析

通過qRT-PCR檢測IcMYB61和IuMYB61基因分別在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的不同部位中的表達情況，從圖6可以看出，IcMYB61和IuMYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的根、莖和葉3個部位（根、莖和葉）及2個不同時期（幼苗期、成熟期）中均有表達。IcMYB61和IuMYB61基因均在2個時期的根中表達量最低，在成熟期的莖中表達量最高；IcMYB61基因在綠萼鳳仙花幼苗期的葉中表達量最高，莖次之，而在成熟期的莖中表達量最高，葉次之。IuMYB61基因在滇水金鳳2個時期均表現出在莖中的表達量最高，葉次之；上述結果表明IcMYB61和IuMYB61基因主要在成熟期的莖和幼苗期的莖和葉中發揮作用。

2.5木質素總量變化分析

從表4中發現，在滇水金鳳和綠萼鳳仙花的莖和葉的木質素總含量存在顯著差異（P<0.05），經對比分析發現，莖的木質素總含量均明顯高于葉的木質素含量，且在滇水金鳳中表現更為顯著；由于滇水金鳳的莖為直立莖，綠萼鳳仙花的莖為匍匐莖，說明木質素的含量與莖的直立程度有關。

3討論

MYB是對植物生長發育過程中影響最大的家族之一，自PAZ-ARES等從玉米（Zeamays）中克隆出首個與類黃酮合成的MYB轉錄因子C1（Colorless1）后[24]，不同植物中的MYB類轉錄因子相繼被克隆，并對其功能進行探究及分析；目前MYB61基因在水稻（Oryzasativa）、神農香菊（Chrysanthemumindicumvar.aromaticum）和模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）等植物中已有研究，其功能主要涉及到纖維素的合成和木質化的異位沉積等[13，16-17]。本研究通過克隆獲得了綠萼鳳仙花和滇水金鳳的MYB61基因，其cDNA全長分別為1035bp和1002bp；基因分別編碼344aa和333aa，且都有一個內含子，均為不穩定親水性蛋白，與白樺MYB61的研究結果一致[25]；CDD分析結果表明IcMYB61和IuMYB61具有2個典型的SANT結構域，與ZHANG等[26]和BOYER等[27]的研究結果相似，與R2R3-MYB亞家族的基本結構研究相吻合[28]，推測IcMYB61基因屬于R2R3-MYB家族；系統發育樹分析發現，IcMYB61和IuMYB61基因與喜馬拉雅鳳仙花聚為一支，驗證了同一屬的親緣關系最近。

植物細胞在所有細胞中都能合成初級細胞壁（primarycellwall，PCW），但只有在特定類型的細胞中才能產生次級細胞壁（secondarycellwall，SCW），如雙子葉植物中的木質部導管和纖維，它們可以傳導水分和提供機械支持[29]；而這些SCW特異性生物聚合物的合成需要由SCW特異性轉錄因子來調控[30]；有研究發現神農香菊CiMYB61在煙草中過表達時，葉和莖的硬度顯著增加，且轉基因株系的木質素含量增加30%～45%[16]；MYB61基因在水稻中過表達也出現植株木質化現象[18]；MYB61在芒草中被認為是直接調控木質素單體形成的基因，能直接激活C4L、CCR和HCT等調控木質素合成的相關基因的表達[17]，MYB61調控木質素合成功能基因在其他單子葉和雙子葉植物中也有報道[30-31]。綜上所述MYB61在促進木質素合成過程中發揮了重要作用。已有研究表明MYB61在大部分植物中均有表達，且在不同植物的不同部位的表達量差異較大，主要在莖和葉中的表達量更高[16，25]；本研究的qRT-PCR分析結果發現，IcMYB61和IuMYB61在2個時期的根、莖和葉中均有表達，在幼苗期和成熟期的根中的表達量均最低，但均在成熟期的莖中表達量最高，與白樺等植物的研究結果一致[16]，推測MYB61主要在鳳仙花的莖中發揮作用。幼苗期時，MYB61基因在綠萼鳳仙花中葉的表達量最高，而滇水金鳳莖的表達量高于葉，這可能是由于在幼苗期滇水金鳳的直立莖比綠萼鳳仙花的匍匐肉質莖的木質素含量更高；在成熟期時，MYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳中，莖的表達量均最高，和本研究的木質素總含量趨勢一致，這與神農香菊的研究結果一致[25]；可以推測IcMYB61和IuMYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的木質化生物合成中發揮了重要作用，但其具體功能及作用機理還有待于進一步的轉基因功能驗證。

本研究發現IcMYB61和IuMYB61基因屬于鳳仙花中的R2R3-MYB亞家族成員，同時對其在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的不同時期不同部位的時空表達模式及相關木質素的含量進行了分析，推測IcMYB61和IuMYB61基因均在木質素生物合成中發揮重要作用，在一定程度上為探究鳳仙花木質素合成的分子機制提供了一定的基礎數據，而且為鳳仙花品種改良及創新提供一定的理論依據。