蒜芥茄PR-10基因的克隆與表達分析

程捷 張涵雪 蔚亞楠 尹夢瑩 董相書 吳麗艷 杜光輝

關鍵詞：蒜芥茄；PR10蛋白；基因克隆；表達分析

病程相關蛋白（pathogenesisrelatedproteins，PRs）是植物受生物或非生物脅迫后誘導產生并積累的一類蛋白質總稱。PR蛋白主要分為17個亞類[1]，廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中。部分PR蛋白（PR2、PR3、PR4、PR8）具有幾丁質酶或葡聚糖酶的活性，對于真菌有一定抑制性[2]。而PR10具有核糖核酸酶活性，可以裂解入侵病毒的RNA，在植物抗病毒途徑中發揮著重要作用[3]。除此之外，PR10對植物的生長、發育和衰老也有一定作用[4]。PR10基因受多種激素誘導表達，如JA、SA、ABA、GA3，也受部分病原體或冷害、干旱等非生物脅迫的誘導表達，一些外源物質H2O2、CuCl2也可以誘導PR10基因的表達[5]；PR10在植物不同組織器官中的表達量也不同，如，PR10基因在大豆的根、莖及葉中均有表達，其中葉部表達最高[6]。多個研究表明，PR10蛋白是分子量為16～19kDa，等電點偏酸性的小分子量蛋白；該蛋白作為一種胞內蛋白，一般定位在細胞質中[7-9]。PR10蛋白可分為特異性細胞因子結合蛋白和乳膠蛋白兩大類[10]。雖然，PR10蛋白參與植物抗病相關途徑的調控，但PR10受各種因素誘導表達的機制尚不明確；PR10蛋白具有核酸酶活性和體外抑菌的特性，但其如何抵御病菌的侵害也有待揭示。

黃萎病是影響茄子產量、由輪枝菌（Verticilliumspp.）引起的一種土傳病害，發病快、危害面積廣。有研究表明，PR10蛋白具有高效的抗真菌作用[11]，對輪枝菌也表現出一定的抗性。例如，棉花的GaPR10基因在受到大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）侵染時，表達水平顯著增高，該基因可能參與了相應的防御反應[12-13]；ZANDVAKILI等[14]發現玉米PR10蛋白有良好的體外抗真菌活性，在接種了黃萎病病菌、菌核病菌等4種真菌后，PR10蛋白均可不同程度地抑制其孢子萌發和菌絲生長。并且，PR10基因對煙草花葉病毒（TMV）也表現出很高的抗性，辣椒CaPR10[3]、刺茄SsPR10[4]與煙草NtPR10[15]基因在TMV侵染過程中表達水平顯著上調，有很好的抗TMV的作用。除此之外，PR10蛋白對疫霉菌[3]、稻瘟病菌[4]、青霉菌[16]等多種病菌都表現出一定的抑制作用，在植物抗病方面發揮重大作用。

蒜芥茄（SolanumsisymbriifoliumLam.），為茄科、茄屬植物，一年生草本，屬于野生茄的一種。蒜芥茄由于長期在野外生存，具有良好的抗逆性，研究表明，蒜芥茄是黃萎病的高抗材料[17]。本研究在前期建立的蒜芥茄轉錄組數據庫[18]的基礎上，通過RT-PCR技術，從蒜芥茄中克隆獲得病程相關蛋白PR-10基因，即SsPR-10。并對該基因進行生物信息學分析及預測，利用熒光定量PCR技術檢測SsPR-10基因在蒜芥茄不同器官的表達特性以及接種黃萎病病菌后表達水平的變化，對蒜芥茄SsPR-10基因應對生物脅迫的表達機制提供一定的理論基礎，有助于進一步開發利用蒜芥茄優良的抗病性狀。

1材料與方法

1.1材料

供試材料野生蒜芥茄由云南省農業科學院園藝作物研究所提供。將蒜芥茄種子用500mg/L的赤霉素（GA3）溶液催芽24h，待種子露白轉移到育苗基質，取成熟期的根、莖、葉進行混樣，作為基因克隆和表達分析材料；待第一片真葉完全展開時用大麗輪枝菌菌株QZ-S（V.dahliaeKleb.）接種，接菌后0、24、48、72h取葉片進行RNA提取，用于目的基因表達分析。

1.2方法

1.2.1SsPR-10基因克隆采用PlantRNAKit試劑盒（Omega，美國）提取蒜芥茄不同器官（根、莖、葉）的RNA，并用分光光度計檢測RNA的純度。再采用5×all-In-OneRTMasterMix（withAccuRTGenomicDNARemovalKit）試劑盒（ABM，加拿大）將RNA反轉錄為cDNA，具體操作按試劑盒說明書進行。利用PrimerPremier5.0軟件設計引物（F：AAAGGCAAATACTAATCAAAC；R：AGAAAACACACAACAAAAAAC），以cDNA為模板，進行目的基因ORF的擴增，引物合成委托昆明擎科生物科技有限公司進行。PCR擴增體系（25μL）為：cDNA1μL，10μmol/L的正反引物各1μL，ddH2O12μL，EsTaqMasterMix（Dye）10μL。反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，35個循環后72℃延伸10min，4℃保存。取5μL的PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將目的基因條帶進行回收后送昆明擎科生物科技有限公司進行測序，將測序結果應用DNAMAN軟件進行序列比對。通過NCBI在線網站的ORFFinder程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對SsPR-10進行開放閱讀框預測。

1.2.2生物信息分析及系統進化樹構建利用ExPasy在線ProtParam軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對SsPR-10蛋白氨基酸的理化性質、親水性、穩定性等進行預測；使用ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）對親水性進行進一步分析。分別用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線網站分析SsPR-10蛋白的二、三級結構，再用Cell-PLoc2.0在線網站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預測SsPR-10的亞細胞定位。使用推定的ORF序列在網站NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）中預測SsPR-10蛋白的磷酸化位點。在TMHMM2.0在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）上預測Ss-PR-10蛋白的跨膜區；利用InterProScan在線網站（http：//www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/）對SsPR-10蛋白進行保守結構域分析預測。利用NCBI數據庫Blast工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對SsPR-10蛋白的氨基酸序列進行同源序列比對，并選取相似度高的蛋白序列應用DNAMAN軟件進行序列比對分析，再使用MEGA軟件利用鄰接法（neighbor-joining，NJ），構建系統進化樹。

1.2.3基因表達分析應用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術對SsPR-10基因在蒜芥茄不同器官中的表達進行分析。引物設計通過PrimerPremier5.0軟件進行，以CYP為內參基因（表1）。對蒜芥茄接種大麗輪枝菌，并在一定時間內（0、24、48h）測定SsPR-10基因的表達，以無菌水處理為對照，具體接種方法參照吳麗艷等[19]進行。試劑盒選用MonAmpTMSYBR?GreebqPCRMix（LowRox）（莫納生物科技有限公司），具體操作按照試劑盒說明書進行。通過實時熒光定量PCR儀進行試驗，每個樣品設置3次重復。PCR反應體系如下：MonAmpTMSYBR?GreebqPCRMix10μL，cDNA溶液1μL，正向引物及反向引物各0.8μL，ddH2O7.4μL，共20μL。PCR擴增程序：95℃預變性2min，繼續95℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，35個循環，72℃終延伸5min。

2結果與分析

2.1SsPR-10基因的克隆與ORF序列分析

以蒜芥茄為材料，提取RNA（圖1A），反轉錄后獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，得到與預期長度符合的PR10基因（圖1B）。測序后，獲得基因序列，全長645bp，命名為SsPR-10。將克隆得到的SsPR-10基因與轉錄組測序的cDNA序列進行比對，相似度為99.85%，其中只有１個堿基變異（圖2）。以測序結果為準，利用NCBI的ORFFinder基因開放閱讀框分析工具進行預測，結果顯示開放閱讀框為480bp，共編碼159個氨基酸（圖3）。

2.2SsPR-10基因的生物信息學分析

2.2.1SsPR-10蛋白理化特性預測利用在線網站ProtParam對SsPR-10進行分析，結果表明SsPR-10編碼的蛋白分子式為C794H1247N207O245S3，總分子量17.71kDa，共編碼159個氨基酸，其中帶正電荷殘基數（Arg+Lys）17個，帶負電荷殘基數（Asp+Glu）25個，理論等電點為5.54，推測該蛋白為酸性蛋白；不穩定系數（II）為34.34，小于40；該蛋白的親水性平均值（GRAVY）為–0.325，為親水性蛋白。在ProtScale程序中，對該蛋白的親疏水性進一步分析（圖4），第23位亮氨酸的疏水性最高為1.733，第122位蘇氨酸親水性最高為–2.267。總體來看，疏水區主要集中在前部，親水區集中在中部、后部，預測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2SsPR-10蛋白二、三級結構和亞細胞定位分析利用在線軟件SOPMA進行SsPR-10蛋白質二級結構預測（圖5A），結果顯示SsPR-10蛋白二級結構主要由4種結構構成，分別為43.40%的α-螺旋、23.27%的β-折疊、8.81%的β-轉角、24.53%的無規卷曲。在線網站SWISS-MODEL對SsPR-10的三級結構進行預測（圖5B），結果顯示SsPR-10的三級結構與草莓過敏原Fraa1-2的相似度達到53.16%，以6stb.1.A作為模板構建。通過Cell-PLoc2.0在線網站對SsPR-10進行亞細胞定位，結果顯示SsPR-10定位在細胞質中。

2.2.3SsPR-10蛋白磷酸化位點及信號肽分析通過在線網站NetPhos對SsPR-10蛋白進行磷酸化位點的預測（磷酸化位點閾值為0.5），共預測了12個磷酸化位點（圖3），第10、52、84、107位的絲氨酸；第12、99、117、122位的蘇氨酸；第83、100、120位的絡氨酸。信號肽預測結果顯示該蛋白無信號肽。

2.2.4SsPR-10蛋白跨膜區和結構域分析利用TMHMM2.0在線軟件對SsPR-10蛋白跨膜區進行分析，發現該蛋白無跨膜區（圖6A）。通過InterProScan在線網站對SsPR-10蛋白進行保守結構域分析預測（圖6B），發現其含有1個BetvⅠ過敏原結構域（IPR024949），其中88～120位存在局部保守序列（圖3）；1個START脂質結合結構域（IPR023393）；1個BetvI/MLP乳膠蛋白結構域（IPR000916）。

2.2.5SsPR-10蛋白同源序列比對和系統進化分析利用NCBI在線網址中BLAST的功能檢索與蒜芥茄SsPR-10蛋白序列相近的其他植物，發現SsPR-10與黃果茄（Solanumvirginianum）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）、番茄（Solanumlycopersicum）、辣椒（Capsicumannuum）、煙草（Nicotianabenthamiana）等的識別度較高。再通過DNAMAN軟件將SsPR-10蛋白序列和這幾種植物PR10蛋白序列進行序列比對分析（圖7），發現它們在位置47～52有一個保守序列，富含甘氨酸的環狀結構“P-LOOP”環。

選擇上述與蒜芥茄SsPR-10蛋白序列相似度較高的植物蛋白序列和SsPR-10序列進行比對（圖7），運用MEGA軟件構建系統進化樹（圖8），結果顯示，蒜芥茄SsPR-10蛋白與黃果茄的PR10蛋白親緣關系最近，其次與馬鈴薯的STH-2蛋白較近。

2.3SsPR-10基因的表達分析

利用RT-qPCR技術對SsPR-10基因在蒜芥茄根、莖、葉中表達情況進行分析（圖9），結果顯示，SsPR-10在根部表達最高，其次是葉，在莖部表達較低。

用黃萎病病菌接種蒜芥茄，對接種后0、24、48、72h的SsPR-10基因的表達情況進行分析（圖10），發現接種后SsPR-10總體表達情況呈先上升后下降的趨勢。當接菌24h后，SsPR-10表達水平增加了3倍左右，且達到最高水平；48h后，其表達水平明顯下降且低于對照；72h后，對照組與接種病菌組中基因表達水平相差不大。

3討論

PR10蛋白是植物病程相關蛋白家族中的第10類蛋白，因其具有一定核酸酶活性，在植物生長發育、抵御病原菌和非生物脅迫方面都有作用，并且在多種植物，如蘋果[20]、大豆[6]、棉花[12]、百合[21]等中都有發現，而受廣大研究者的關注。多個研究表明，PR10基因編碼的氨基酸中都具有一個高度保守的GXGGXG（X是任意氨基酸）序列模型，被稱為“P-LOOP”環[5，22]，這一保守結構可能與PR10蛋白的磷酸化有關。PARK等[3]研究發現，辣椒CaPR10蛋白磷酸化的活性比未磷酸化的活性高約12倍，并預測了其絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點；同樣，OZYIGIT等[22]預測了大豆、水稻、番茄等6種植物的PR10蛋白三級結構和它們的配體結合位點，這些結合位點上的殘基有著更高程度的變異，可能形成具有不同功能、新的催化位點。

蒜芥茄作為重要的野生茄資源，其部分抗病性狀比栽培茄更有優勢，但對其有利基因的挖掘還不深入。目前，關于蒜芥茄抗黃萎病相關基因Ve基因與泛素結合酶（E2s）UBC基因的分子機制已經得到初步分析[17，23]，而對于蒜芥茄PR-10基因的研究還未被報道。本研究通過RT-PCR技術獲得蒜芥茄PR-10基因的序列，并對其進行相關生物信息學分析和表達分析。對預測的蛋白序列進行理化檢測發現SsPR-10蛋白大小為17.71kDa，等電點為5.54，屬于親水性蛋白，而LIU等[4]研究刺茄SsPR10蛋白，發現其大小為17.58kDa，等電點為5.29，共編碼160個氨基酸。ZHOU等[12]從棉花中分離的GaPR-10基因所編碼的PR10蛋白分子量為17.3kDa，等電點為4.95，編碼159個氨基酸；張弛等[9]研究了楊樹PR10基因編碼的蛋白，發現其分子量為17.6kDa，等電點為5.20，編碼158個氨基酸，也為親水性蛋白。以上研究結果與本研究相近，可證明PR10蛋白為小分子量（不超過20kDa）酸性親水性蛋白。本研究預測了SsPR-10蛋白在細胞中的定位，結果顯示在細胞質中，對SsPR-10進行跨膜區分析，發現SsPR-10無跨膜區；信號肽分析也表明SsPR-10無信號肽。張玉等[15]研究了煙草NtPR10蛋白的定位，發現其定位在細胞質，并對NtPR10蛋白進行了信號肽和跨膜結構域預測，發現該蛋白無信號肽和跨膜結構域；NAOKI等[24]在研究水稻PR蛋白時，也發現其定位在細胞質，這些研究結果與本研究預測蒜芥茄PR10蛋白的定位一致，而OZYIGIT等[22]對于海島棉、王百合和藏紅花的亞細胞定位結果顯示PR10蛋白在葉綠體和細胞質中。這些結果表明PR10蛋白是不含信號肽的胞內蛋白。

本研究對SsPR-10以及其近緣物種進行序列比對，發現存在保守序列GXGXG（47～51位，X為任意氨基酸），稱為“P-LOOP”結構，且存在結構域Bet-v1。“P-LOOP”是一個有關磷酸結合激酶以及核苷酸結合蛋白的結構域，是PR10蛋白家族的特征結構。而BetvⅠ相關蛋白家族由許多結構相關的植物過敏原組成；該結構中存在若干疏水配體結合位點，這些位點可以形成一個大的“Y”型疏水配體結合口袋，可以結合油菜素內酯（brassinolide，BR）等并起到轉移極性配體的作用，可能參與到植物的病理防御作用[21]。前人研究表明，刺茄的SsPR10蛋白[4]以及辣椒的CaPR10蛋白[3]均含有保守序列GXGGXG（47～52位），與本研究結果相比較這2種蛋白在第50位多了一個甘氨酸；而馬鈴薯的PR10蛋白在第45～47位含有保守序列GXG[4]，這與本研究結果也有一定差異。推測不同的P-LOOP模式和甘氨酸殘基的位置變化可能是PR10基因進化過程中替換、缺失和插入的結果。

有研究表明，在植物的根、側根和根尖等易受機械干擾和病原菌侵襲的部位，PR10表達量會顯著增加[22，25]。本研究發現SsPR-10基因在根部的表達明顯高于在莖、葉的表達量，存在明顯的組織特異性。在接種大麗輪枝菌24h后，蒜芥茄PR-10基因的表達量最高，相當于對照組的4～5倍；而24～48h，PR-10的表達量下降較多，SsPR-10表達水平由上調變為下調；72h后，該基因表達量與對照組相差不大。亞洲棉GaPR10基因[12]在根部有低水平的轉錄，而在葉片、花、莖中都不表達，也屬于組成型表達；楊樹PR10基因[9]與刺茄的PR10基因[4]在根系的表達量也高于葉片和莖。但是，大豆PR10基因在葉部的表達量高于莖部和根部[6]。辣椒和刺茄在接種TMV后，其PR10基因表達量均大幅增加[3-4]；同樣，亞洲棉用大麗輪枝菌處理后，PR10基因在12h內達到最高水平的表達，并在24h內保持高水平的表達[12]，這與本研究SsPR-10響應大麗輪枝菌接種的反應相近。雖然SsPR-10在根、莖、葉等部位可以表達，但比接種病菌后其表達是明顯較低的，這表明SsPR-10受到病菌誘導時，表達水平會顯著上升。

4結論

本研究從蒜芥茄中克隆得到了病程相關蛋白SsPR-10基因，該基因編碼區全長480bp，共編碼159個氨基酸。SsPR-10蛋白無跨膜區和信號肽，屬于胞內蛋白，與黃果茄PR10蛋白親緣關系最近。蒜芥茄SsPR-10基因的表達具有組織特異性，并受大麗輪枝菌的誘導而高表達，說明SsPR-10基因可能參與蒜芥茄抗黃萎病的應答過程。