嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態的致病力及侵染行為

呂朝軍 趙建超 鐘寶珠 張楚毓 陳拓 李文蓮

關鍵詞：嗜菌異小桿線蟲；致病力；紅棕象甲；形態學

紅棕象甲（RhynchophorusferrugineusOliver）是我國重要的檢疫性害蟲，分布于海南、廣東、廣西、重慶、臺灣、云南、西藏、香港、澳門、江西、上海、四川、貴州、浙江、福建等地[1-2]，也是世界上椰子（CocosnuciferaL.）、油棕（ElaeisguineensisJacq.）、椰棗（PhoenixdactyliferaL.）等棕櫚科作物的重大害蟲。該蟲主要通過鉆蛀植物的莖干和生長點危害，由于其為害隱蔽，在植株表現癥狀時多數已無法挽救。

目前生產上對于紅棕象甲的防治方法包括莖干注射[2]、藥劑噴霧[3]、信息素誘捕[4]等。在該蟲生物防治方面已取得了一些成就[5-7]，其中昆蟲病原線蟲（entomopathogenicnematodes，EPNs）作為重要的生防因子之一[7]，可與其他生物形成共生關系[8]，截至2015年底，已報道95種斯氏線蟲和16種異小桿線蟲[9]。BARBARA等[10]研究了斯氏線蟲（Steinernemacarpocapsae）對紅棕象甲的致死效果，及其對紅棕象甲生長發育及幼蟲的免疫活性等影響，當EPNs通過肛門、氣孔和口腔進入宿主后，會在宿主血腔中釋放共生細菌引起細胞毒性，并引起敗血癥導致宿主死亡[11]；田間試驗結果表明，EPNs對紅棕象甲的預防效果達98%，治愈率達80%[12]。同時嗜菌異小桿線蟲（Heterorhabditisbacteriophora）和昆蟲病毒以1∶5混合對紅棕象甲的防治效果較好[13]；嗜菌異小桿線蟲與白僵菌（Beauveriabassiana）混用對于紅棕象甲幼蟲具有增效作用，尤其對低齡幼蟲的增效作用更顯著[14]。目前針對EPNs侵染紅棕象甲的研究多集中在幼蟲，而較少報道對其他蟲態是否有致病性的研究，因此本文研究了嗜菌異小桿線蟲H06（HeterorhabditisbacteriophoraH06）品系對紅棕象甲各蟲態的致病力，并對其侵染途徑及侵染過程等進行系統觀察，以期為紅棕象甲生物防治策略的科學制定提供參考。

1材料與方法

1.1材料

紅棕象甲和嗜菌異小桿線蟲H06品系均由中國熱帶農業科學院椰子研究所生物防治實驗室自繁自養。其中紅棕象甲采用半人工飼料[15]飼養；嗜菌異小桿線蟲H06品系以大蠟螟幼蟲為寄主進行擴繁，采用Whitetrap法[16]收集3齡侵染期線蟲（infectivejuveniles，IJs），用蒸餾水稀釋成系列濃度，備用。

試蟲繁育及實驗均在溫度（26±1）℃，相對濕度70%±5%的昆蟲繁育室開展。

1.2方法

1.2.1嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲的致病力測定養蟲杯（直徑4cm，高3cm）杯底覆蓋濾紙，杯頂置通氣孔，用移液槍滴加1mL不同濃度線蟲液至濾紙上，將紅棕象甲5個齡期段（1～2齡、3～4齡、5～6齡、7～8齡、9～10齡）幼蟲、卵、蛹、成蟲分別置于養蟲杯中。處理5d后統計試蟲死亡率，并以對照組死亡率對處理死亡率進行校正。每處理30頭，重復3次，以蒸餾水處理為對照。幼蟲、蛹、成蟲死亡標準：以昆蟲針輕觸蟲體，完全不動者為死亡。卵死亡標準：以變紅色或黑色為死亡。

死亡率=死亡蟲口數/處理總蟲口數×100%

校正死亡率=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100%

1.2.2紅棕象甲不同蟲態被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后的形態學變化使用線蟲液（500IJs/mL）分別對紅棕象甲6齡幼蟲、預蛹、初產1d卵、新羽化成蟲進行處理。其中幼蟲和預蛹滴加200μL于前胸背板處，成蟲滴加200μL于前胸背板和中胸之間連接處，卵直接在線蟲液中浸漬5s取出，處理后將試蟲單獨放置于養蟲盒中，成蟲和幼蟲以甘蔗塊為補充營養。處理72h后用索尼攝像機（FDR-AX700）拍照記錄紅棕象甲各蟲態被EPNs侵染后的典型形態學變化。

1.2.3嗜菌異小桿線蟲H06品系從紅棕象甲幼蟲不同部位的侵入效果選取紅棕象甲3齡、6齡、8齡幼蟲，以每克蟲體重接種100IJs劑量嗜菌異小桿線蟲H06品系，分別接種于紅棕象甲口器、氣孔和肛門周圍，處理4d后統計死亡蟲數。死亡標準為用昆蟲針輕觸蟲體，完全不動者為死亡。每處理接種30頭，重復3次，以未接種處理為對照。

1.2.4嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲腹側氣孔的侵入行為觀測以紅棕象甲8齡幼蟲為寄主，接種24h后觀察蟲體氣孔周圍嗜菌異小桿線蟲H06品系的分布情況。為便于觀察，用防水藍色記號筆在紅棕象甲幼蟲氣孔處進行輕微涂抹，利用解剖鏡（鳳凰XTL-165-LD500u）持續觀察線蟲從紅棕象甲氣孔侵入蟲體的過程并記錄。

1.3數據處理

致病力測定結果中，根據黃劍等[17]的方法，采用Excel統計軟件求毒力回歸方程及LC50、LC50的95%置信區間等。嗜菌異小桿線蟲H06品系致病力數據采用試蟲的校正死亡率進行分析，采用鄧肯氏新復極差檢驗法（DMRT法）進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態的致病力

紅棕象甲各蟲態均可被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染（表1）。從毒力測定結果可知，嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲卵和1～2齡幼蟲的毒力水平最高，二者無顯著差異。隨著幼蟲齡期增加，紅棕象甲對嗜菌異小桿線蟲H06品系的敏感性逐漸降低，其LC50值逐漸增大；嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲蛹和成蟲的致病力無差異，但均低于卵和1～6齡幼蟲。此外，5～6齡幼蟲與7～8齡幼蟲之間、7～10齡幼蟲與蛹之間、9～10齡幼蟲與成蟲之間對嗜菌異小桿線蟲H06品系的敏感性均無顯著差異。

2.2紅棕象甲不同蟲態被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后的形態學變化

經嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后，紅棕象甲幼蟲、預蛹、蛹和卵均死亡，輕觸蟲體無自主反應，體色變成紅色或紅褐色，同時伴隨蟲體體壁皺縮僵硬。成蟲經嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后體色加深，體表斑紋逐漸消失（圖1）。

2.3嗜菌異小桿線蟲H06品系對不同齡期紅棕象甲幼蟲不同部位的侵入效果

紅棕象甲幼蟲不同部位被嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后，紅棕象甲死亡率如表2所示。紅棕象甲3齡幼蟲的接種處理中，以氣孔和肛門處接種的致死率較高，且二者無顯著差異，分別為91.11%和78.89%，均顯著高于口器接種處理；而在6齡幼蟲和8齡幼蟲的接種處理中均以口器接種致死率最高，分別為95.56%和98.89%，其次為肛門接種和氣孔接種。

口器接種處理中，6齡和8齡紅棕象甲幼蟲死亡率無顯著差異，但均顯著高于3齡幼蟲死亡率；在氣孔接種處理中，3齡幼蟲的死亡率顯著高于6齡和8齡幼蟲；而在尾部肛門接種處理中，供試3個齡期的紅棕象甲幼蟲死亡率無顯著差異。

2.4嗜菌異小桿線蟲H06品系從紅棕象甲幼蟲氣孔侵入的行為觀測

研究結果表明，嗜菌異小桿線蟲H06品系接近紅棕象甲氣孔后，在氣孔周圍停留一段時間，之后從氣孔進入蟲體（圖2），從開始進入氣孔至完全進入蟲體整個過程持續2～5min；部分線蟲在進入氣孔的過程中會退出，亦有部分線蟲直接從氣孔上爬過而不侵入蟲體，接觸到紅棕象甲蟲體氣孔的線蟲且成功進入蟲體的比例為33.33%。

3討論

EPNs作為一種生防因子，已經在部分害蟲的防治上得到了應用。如小卷蛾斯氏線蟲（Steinernemacarpocapsae）All品系與草地貪夜蛾數量比為劑，可長期較好地抑制小地老虎對煙草幼苗的危害[19]；600IJs/mL線蟲液處理24h后，Wn01線蟲對紅脈穗螟的校正死亡率達到86.67%[20]。SHAHINA等[21]研究發現，供試的7種EPNs對紅棕象甲各蟲態均具有較好的致病效果；在阿聯酋椰棗園紅棕象甲的防控實驗結果顯示，一種本土分離的Heterorhabditisindicus線蟲能在短時間內滅殺紅棕象甲幼蟲、成蟲和蛹[22]。由于EPNs對昆蟲宿主的高致病性[23]，小卷蛾斯氏線蟲（SteinernemacarpocapsaeWeiser）和嗜菌異小桿線蟲（H.bacteriophoraPoinar）[24]已制作成生防制劑并用于有害生物綜合治理（IPM）中。前期研究顯示，嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲具有一定的致死作用，且蟲體呈現出僵硬皺縮、體色變褐、身體腫脹直至蟲體腐爛、線蟲游離而出的現象[7]。本研究進一步證明，嗜菌異小桿線蟲H06品系不僅可侵染紅棕象甲幼蟲，同時對紅棕象甲蛹、成蟲、卵等也具有侵染活性。其中對紅棕象甲卵和1～2齡幼蟲的毒力水平最高，這可能與不同蟲態對EPNs的耐受力差異有關，也說明在紅棕象甲卵期和低齡幼蟲期利用嗜菌異小桿線蟲H06品系進行可取得較好的防效。

EPNs侵染寄主的方式分為3種：潛伏型、攻擊型和中間型[25]。其中斯氏線蟲的垂直擴散能力較強，搜索策略為潛伏型，而異小桿線蟲對寄主的感應強烈且主動搜索力較強，適于侵染隱蔽性害蟲[26-27]。本研究發現，嗜菌異小桿線蟲H06品系在有水為介質的情況下會游離至紅棕象甲幼蟲氣孔附近，并通過氣孔進入蟲體，但觀察發現其進入蟲體氣孔無目的性，即并不是所有抵達氣孔的線蟲均會侵入至蟲體，因此嗜菌異小桿線蟲H06品系從紅棕象甲氣孔侵入蟲體，是由氣孔散發的氣味吸引其向氣孔定向移動？還是偶然經過氣孔附近進而侵入？還需進一步深入研究。

EPNs侵入蟲體后會釋放共生細菌，通過細菌毒素和線蟲消耗寄主營養致寄主死亡[28]，蟲尸棕色表示該蟲是由斯氏線蟲侵染所致，而紅色則為異小桿線蟲侵染所致，顏色差異是由于尸體中共生細菌釋放的色素不同[10]，本研究結果也表明，經嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后，紅棕象甲的卵、幼蟲、預蛹、蛹及成蟲等各蟲態體色均變成紅色或紅褐色，此結果與王國漢等[28]發現的異小桿線蟲侵染蟲體后導致寄主尸體初為桔紅色、后期為紅褐色一致。

EPNs從紅棕象甲幼蟲不同部位接種后，死亡率存在顯著差異，其中3齡幼蟲處理中，以氣孔和肛門處接種的致死率較高，而6齡和8齡幼蟲處理均以口器接種致死率最高。在氣孔接種處理中，3齡幼蟲的死亡率較高；而在尾部肛門接種處理中，供試3個齡期的紅棕象甲幼蟲死亡率無顯著差異，究其原因可能與紅棕象甲幼蟲的氣孔、口器及肛門的發育特征有關，其致病機理還需進一步深入研究。