先天性巨結腸家系EDNRB基因重復突變1例報道并文獻復習

丁輝陽 雷雯 許露 肖尚杰 周佳亮 原麗科 黃蓉 張亮 朱小春

1廣東省婦幼保健院新生兒外科，廣州 511400；2廣東省婦幼保健院婦幼研究所，廣州 511400

先天性巨結腸（Hirschsprung's disease，HSCR，OMIM 142623）是一種先天性疾病，其特征是缺乏腸神經節細胞，導致胃腸動力障礙，是新生兒功能性腸梗阻的主要原因，其發病率為1/4 000～1/5 000，男女發病率比為4∶1。目前普遍認為，HSCR主要發病機制與腸神經嵴細胞的正常遷移、增殖、分化和存活異常有關，以及與腸祖細胞壁的相互作用受損，這個過程對于腸神經系統（enteric nervous system，ENS）的正常發育至關重要。ENS是一個十分復雜的過程，受其自身各種基因與環境中各種調控因子的影響和精確調節。許多報道已經研究了HSCR可能的遺傳原因，據報道超過24個基因和7個染色體位點在HSCR的發展中起著重要作用，其中配體酪氨酸蛋白激酶受體（RET）和內皮素受體B（EDNRB）作為與HSCR疾病相關的主要基因在多個病例中被檢測到［1-3］。RET基因突變占散發病例的20%和家族性病例的50%［2］。EDNRB基因突變占所有HSCR病例的5%～10%［3］。對東亞人群中的短段型HSCR（short-segment HSCR，S-HSCR）病例進行全外顯子組測序（WES）分析，EDNRB基因突變總體風險高于RET［4］。當家族中出現HSCR復發時，子代患病的風險會增加200倍［5-6］，即使在具有明顯單基因遺傳的家系中，家系內和家系間表現出不完全外顯率和表型嚴重程度不一致的情況，這可能推論出其他一些因素參與到HSCR形成過程，例如基因修飾、隨機表達、環境因素等［7］。

資料與方法

1.臨床資料

患者1：母親（Ⅱ2）被診斷為HSCR（具體病情不詳）并在3歲時接受手術，術后未發生并發癥，此后也未出現腸道相關問題。

患者2：患者1的女兒（Ⅲ1），通過輔助生殖技術孕2產1，在妊娠40周后于2021年4月14日出生，出生體質量為3 150 g。出生后當天患兒進食后出現腹脹，伴嘔吐綠色胃液，未自行排胎便，無嘔血、發熱、發紺等異常，予灌腸后可見較多墨綠色胎糞，腹部平片提示腸管積氣并明顯擴張，灌腸造影顯示直腸段及乙狀結腸遠端狹窄，直腸壺段呈“S”形，降橫結腸明顯擴張，回盲部結構未見異常。該患兒被診斷為HSCR常見型，并在出生84 d時接受了外科手術。

本研究經廣東省婦幼保健院醫學倫理委員會審批通過（202001101），已簽署知情同意書。

2.WES和Sanger測序

2.1.樣品和DNA提取 該患兒家屬簽訂知情同意書后，收集了該家庭成員的外周血樣本。獲得母親的兄弟和他女兒的口腔拭子用于測序驗證?；蚪MDNA提取使用RelaxGene血液DNA試劑盒（中國北京天根生物科技有限公司）從300 μl外周血樣本或口腔拭子中獲得。提取的DNA于-20 ℃保存，為測序做準備。

2.2.WES檢測 使用Agilent SureSelect Human All Exon Kit v6（Agilent Technologies， Inc.， Santa Clara， CA， USA）進行基因組DNA雜交；使用Illumina HiSeq X Ten 平臺（Illumina，Inc.， San Diego，美國加利福尼亞州）測序及文庫構建。

2.3.數據分析 數據分析結果進行分析和注釋，生成的bam文件由SAMtools進行排序?；蚪M分析工具包（GATK；https：//software.broadinstitute.org/gatk/）用于檢測SNV和插入缺失（＜50 bp），并應用CNVki（t17）檢測拷貝數變異（CNV）。為了使用SNV數據計算純合子比率，采用了以下規則：（1）去除了深度＜20x的SNP；（2）只有變異等位基因頻率在0.2和0.8之間的SNP被認為是雜合。

2.4.EDNRB基因外顯子2測序 通過PCR擴增EDNRB基因的外顯子2。正向（F）和反向（R）引物序列如下：EDNRB（F）5'-CAGAGATAATGACGCCACCC-3'和（R）5'-CGATCAAGATATTGGGACCG-3'，擴增程序包括95 ℃變性步驟（10 min），95 ℃（30 s）、52 ℃（20 s）和72 ℃（40 s）40個循環。PCR產物用正向引物測序。

3.文獻檢索

檢索萬方、維普、中國知網、PubMed、Medline數據庫，搜索關鍵詞“：先天性巨結腸（Hirschsprung's disease）“”EDNRB基因（EDNRB gene）”，檢索2022年10月前公開發表的文獻。剔除標準：（1）剔除無法獲得全文資料的文獻；（2）對同一作者、醫院、研究所、數據庫重復報道突變予以剔除。檢索到15篇相關文獻（共報道26個可能致病的突變位點）。

結果

1.基因分析

WES和Sanger測序在4個家系成員中鑒定出1個新的EDNRB基因重復突變c.367delinsTT（p.L123Fter32），該突變會導致基因移碼，32個核苷酸的變化（c.123_155ter），使155位的氨基酸過早產生終止密碼子，從而生成功能區完全缺失的蛋白質（圖1、2）。外婆和母親的染色3inv（3）（p11.2p23）和染色體9inv（9）（p12q13）均出現倒置。該家系的RET基因未檢測到突變。4名家系成員均是EDNRB雜合突變攜帶者，其中母親和女兒患病通過手術治療成功，外婆和舅舅并未表現出巨結腸的臨床癥狀，見表1。該雜合突變在家系中的外顯率為50%。

表1 4例EDNRB基因雜合突變攜帶者的臨床資料

圖1 三代家族系譜（Ⅰ～Ⅲ）

圖2 經Sanger測序驗證的二代測序結果。Z001：患者1（母親），Z002：患者2（女兒），Z003：外婆，Z004：父親，Z005：母親的弟弟，Z006：弟弟的女兒

2.文獻分析

以“EDNRB基因”“HSCR”中英文為關鍵詞，檢索萬方、維普、中國知網、PubMed、Medline數據庫。在HSCR患者中報道了EDNRB基因的多種突變，包括缺失/插入突變、無義突變、剪接突變和幾種錯義突變。EDNRB基因突變被發現存在于幾種臨床癥狀中，最常見的是在HSCR和Shah-Waardenburg綜合征（WS4）［8］，或者HSCR合并唐氏綜合征［9］，HSCR合并多發性硬化癥（MS）［10］，這些報道表明EDNRB基因位于多個基因調控網絡中并影響早期胚胎發育。EDNRB遺傳風險預測具有輔助診斷、提供遺傳咨詢、告知治療方案的潛在臨床應用價值。與HSCR致病相關的EDNRB變異位點，包括我們在研究中發現的位點，如表2所示。

表2 目前已報道的EDNRB基因變異位點

討論

在此研究中，我們調查了1個患有HSCR疾病的家系，并發現了1個新的EDNRB突變。其中4個家系成員中攜帶1個新的 c.367delinsTT（p.L123Fter32） EDNRB雜合突變。該突變導致155位的氨基酸過早形成終止密碼子，產生功能區完全缺失的蛋白質。我們得出結論，EDNRB基因c.367delinsTT（p.L123Fter32）突變可能對HSCR具有致病性。EDNRB（Chr 14位置103814625-103844173 bp）被確定為HSCR的潛在候選基因。人類基因組包含EDNRB基因的單個拷貝，該基因長度24 kb，包含7個外顯子和6個內含子，編碼442個氨基酸的蛋白質［25-26］。EDNRB是黑色素母細胞和腸神經母細胞遷移所必需的，通過EDNRB的信號傳導對于ENS的發育至關重要，EDNRB基因的突變導致人類HSCR神經節細胞缺乏癥。Shin等［27］確定EDNRB在胚胎第10天和第12.5天之間的神經嵴發育期內是必需的。Lee等［28］研究表明，EDNRB蛋白及其配體edn3在小鼠的腸神經嵴細胞系及人黑色素瘤細胞系的發育及分化過程中起至關重要的作用。EDNRB基因點突變的小鼠模型表現出HSCR表型。

患兒雜合突變基因遺傳自她健康的外婆，這一事實表明其他未鑒定的基因區域（內含子和啟動子）或其他因素可能導致該家系中HSCR疾病的發生。表觀遺傳變異在人類疾病的發展過程中起著重要作用。啟動子甲基化引起的轉錄沉默已被認為是抑癌基因失活的一種常見機制［29］。EDNRB的5’端含有大量的CpG重復序列，這些CpG位點的甲基化可以調節基因表達［30］。啟動子甲基化可引起基因表達的沉默，異常甲基化與mRNA轉錄減少有關［30］。Eberle等［30］檢測到在HSCR中EDNRB基因低甲基化水平高于對照組，EDNRB表達的調節可能是由于在HSCR中檢測到的異常甲基化引起的。本家系中HSCR疾病的外顯率為50%，我們推測EDNRB基因啟動子區域的不同甲基化方式使外婆和舅舅不患病，而母親和女兒表現HSCR癥狀。

HSCR中EDNRB異常表達的可能有至少兩種機制：基因突變和異常啟動子甲基化［31］。該突變對劑量敏感，純合子和雜合子發生HSCR的風險分別為74%和21%［22］。本研究中EDNRB基因雜合突變的風險為50%，高于常見的雜合突變。臨床觀察男性的巨結腸發生率顯著高于女性，而該家系未出現男性患病情況。目前，對于HSCR的發病機制沒有統一的定論，基因突變也只能解釋70%左右的病例，說明HSCR是一種具有復雜遺傳模式的多基因遺傳?。?2］。任何影響ENS發育過程的調控因子出現異常，這些調控基因均可能成為HSCR致病基因。

我們研究了患有HSCR家系中EDNRB突變的遺傳原因，4名成員是EDNRB雜合子突變攜帶者，2名患病成員有明顯HSCR癥狀，而其他人則表現健康。我們假設新的EDNRB（L123Fter32）突變只是致病因素之一。WES會忽略內含子區域和啟動子區域甲基化程度。EDNRB基因的啟動子區低甲基化可能在HSCR的發生發展中起作用。啟動子甲基化對突變基因的致病外顯率影響需要更多HSCR病例進行基因修飾分析來證實。外婆和母親均有倒置染色體3inv（3）（p11.2p23）和染色體9inv（9）（p12q13），但與疾病無相關性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明丁輝陽：醞釀和設計試驗，實施研究，采集、分析/解釋數據，起草文章，獲取研究經費；雷雯：醞釀和設計試驗，實施研究，采集、分析/解釋數據，起草文章，統計分析；許露：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，指導；肖尚杰、周佳亮、原麗科、黃蓉：對文章的知識性內容作批評性審閱，指導，支持性貢獻；張亮：醞釀和設計試驗，實施研究，分析/解釋數據，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻；朱小春：醞釀和設計試驗，實施研究，采集數據，對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻