基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究高原低氧對小鼠T、B淋巴細(xì)胞信號通路的影響*

許玉珍,王嘉陽,胡 英,龍啟福,繆增強(qiáng),永 勝

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,青海 西寧 810016)

氧對哺乳動物有氧代謝至關(guān)重要[1]。高原地區(qū)氧含量的下降會削弱有氧代謝,引起機(jī)體循環(huán)功能下降,導(dǎo)致組織、器官的營養(yǎng)和能量減少,造成不同程度的氧化損傷,誘導(dǎo)高原肺水腫[2]和高原腦水腫[3]等高原病的發(fā)生。因此,研究高原病的發(fā)病機(jī)制成為近年來高原醫(yī)學(xué)備受關(guān)注的課題。有研究表明,低氧會影響免疫細(xì)胞的新陳代謝和功能,且與高原病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系,且高原低氧(HST)環(huán)境可以調(diào)節(jié)免疫基因的表達(dá)、影響機(jī)體免疫功能、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生等[4]。此外,KIANI等[5]研究發(fā)現(xiàn),在低氧環(huán)境下,磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)和核因子κB(NF-κB)共同調(diào)控T、B細(xì)胞受體活化信號,在固有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。然而,HST刺激如何調(diào)控機(jī)體免疫功能的研究仍然有限,因此深入了解低壓低氧刺激如何調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答過程,進(jìn)而適應(yīng)低氧脅迫是亟待解決的重要科學(xué)問題。

眾所周知,脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,含有大量的淋巴細(xì)胞,在細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答過程中都發(fā)揮著不可或缺的作用。據(jù)報道,HST脅迫下,低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)通過抑制雷帕霉素復(fù)合物1(mTORC1)介導(dǎo)的骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物(Myc)相關(guān)通路調(diào)節(jié)Tfh與Th1細(xì)胞的發(fā)育,促進(jìn)生發(fā)中心B細(xì)胞的增殖[6]。此外,LI等[7]研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α是前B細(xì)胞中miR-582的靶點,敲除miR-582后,激活mTORC2,增強(qiáng)HIF-1α的表達(dá)和Akt磷酸化,促進(jìn)前B細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)早期B細(xì)胞的分化發(fā)育。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),新型冠狀病毒感染患者B細(xì)胞中出現(xiàn)低氧有關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化,引起B(yǎng)細(xì)胞發(fā)育異常,包括B細(xì)胞減少、抗體類別的轉(zhuǎn)換和親和力成熟等,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)加劇和自身免疫反應(yīng)的發(fā)生,提示在新型冠狀病毒感染中,適當(dāng)?shù)脑缙谘醑煏纳泼庖叻磻?yīng),利于疾病的恢復(fù)[8]。上述研究提示低氧與T、B細(xì)胞分化發(fā)育密切相關(guān),探究T、B細(xì)胞響應(yīng)低氧應(yīng)激的分子機(jī)制為臨床免疫療法提供新思路。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)成為了解低氧脅迫影響免疫反應(yīng)及其通路和基因表達(dá)的有力工具。RNA測序(RNA-seq)的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)可以從大量轉(zhuǎn)錄信息中識別差異表達(dá)基因(DEGs),分析核心調(diào)控通路,成為探究低氧脅迫機(jī)體各個組織系統(tǒng)響應(yīng)免疫應(yīng)答機(jī)制不可或缺的工具[9]。有研究發(fā)現(xiàn),低壓低氧環(huán)境下大鼠腸道模型中PPAR信號通路、礦物質(zhì)吸收、甘油三酯代謝、脂肪消化和吸收等消化相關(guān)代謝途徑在京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路分析中顯著富集,為大鼠在低氧環(huán)境下胃腸道調(diào)節(jié)的潛在分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)[10]。ZHOU等[11]研究發(fā)現(xiàn),低壓低氧暴露的幼年鳙魚心臟模型中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號、細(xì)胞凋亡和腎上腺素信號等相關(guān)代謝途徑在KEGG通路分析中得到了高度富集,為幼年鳙魚在低氧環(huán)境下的應(yīng)激分子機(jī)制提供線索。這些研究提示,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在探究低氧脅迫適應(yīng)的分子機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

因此,本實驗采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究HST脅迫對小鼠脾臟T、B細(xì)胞的影響,挖掘與T、B細(xì)胞受體相關(guān)通路和關(guān)鍵基因,明確其在HST條件下T、B細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制,為揭示低氧脅迫下免疫細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡的SPF級C57BL/6小鼠,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,動物許可證號:SYXK 2020-005,飼養(yǎng)于溫度為18～22 ℃、濕度為45%～55%的實驗動物房中,自由飲水、進(jìn)食,保持環(huán)境衛(wèi)生。待小鼠適應(yīng)周圍環(huán)境后,將小鼠隨機(jī)分成2組,每組5只。對照組即平原常氧組(PSC組),在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(海拔400 m)飼養(yǎng)30 d;實驗組即HST組,在青海省果洛藏族自治州瑪多縣人民醫(yī)院實驗動物房(海拔4 200 m)。30 d后無菌采集小鼠脾臟組織置于液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus,RR820A,Takara,日本);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser,RR047A,Takara,日本);Trizol裂解液(美國Invitrogen公司)。

1.3方法

1.3.1總RNA提取和Illumina測序 從各組小鼠脾臟中提取總RNA(常規(guī)Trizol法),將總RNA中純化的mRNA打斷并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)末端修復(fù)、PCR擴(kuò)增等過程制備mRNA-Seq文庫進(jìn)行Illumina測序。

1.3.2RNA-Seq質(zhì)量評估和序列比對 為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性,對高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過濾,主要包括去除原始數(shù)據(jù)中有測序接頭(adapter)的reads或測序質(zhì)量較低的reads,對clean data 進(jìn)行后續(xù)高質(zhì)量分析。使用 HISAT2軟件構(gòu)建索引,將配對末端 clean reads 與參照基因組比對,采用皮爾遜相關(guān)性檢測對樣本的基因表達(dá)水平進(jìn)行精確分析。

1.3.3DEGs分析 對PSC組和HST組通過DESeq2統(tǒng)計軟件,基于負(fù)二項式分布模型進(jìn)行差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析。用FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)對基因長度和深度校正其表達(dá)水平。以|log2FC|≥0作為顯著差異表達(dá)的閾值。

1.3.4基因本體(GO)注釋、KEGG分析和基因富集分析 采用clusterProfiler (3.4.4)富集分析,找出DEGs顯著富集的GO條目并計算P值。GO(http://www.geneontology.org/)即基因本體數(shù)據(jù)庫,包括生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)3個部分。

KEGG(http://www.kegg.jp/)是分子水平的數(shù)據(jù)庫資源,通過高通量數(shù)據(jù)庫,了解細(xì)胞、生物體和生態(tài)系統(tǒng)的高級功能和效用。采用 clusterProfiler(3.4.4)軟件分析計算KEGG通路中DEGs即P<0.05視為顯著富集。基因集富集分析GSEA(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp):從基因集富集分析的角度出發(fā),針對有重要生物學(xué)意義但差異表達(dá)較小的基因進(jìn)行功能富集分析,作為KEGG數(shù)據(jù)集的補(bǔ)充工具。

1.3.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)驗證 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,cDNA合成是按照制造商的說明使用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行。以β-actin作為內(nèi)參,檢測PD-1、CTLA4、CD45、CD4、CD8a、CD8b1、CD3e、ICOS、CD28、CD40L、PIR-B、CD22、CD72、Igα、Igβ、FcgRIIB、LEU13、CD81、CD19、CD21、SHP1、GRB2、SOS、Ras、Raf、MEK1/2、p38、NFAT、PI3K、Akt、GSK-3β、NIK、IKKα、NF-κB、IκB、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)量,引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結(jié) 果

2.1PSC組和HST組脾臟DEGs 30 d的HST處理后,以|log2FC|≥0和P-校正<0.05為篩選條件,共鑒定出4 213個DEGs,其中1 947個基因表達(dá)上調(diào),2 266個基因表達(dá)下調(diào)(圖1)。為了研究PSC和HST下脾臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間的樣本異質(zhì)性,對各組樣品進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析(圖2),結(jié)果表明各樣本間基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)R2>0.95,提示生物學(xué)重復(fù)樣本間基因表達(dá)情況較為一致,實驗數(shù)據(jù)可靠,且小鼠脾臟組織在不同海拔高度下對低氧誘導(dǎo)反應(yīng)有差異。

圖1 DEGs柱

圖2 Pearson相關(guān)性系數(shù)分析

2.2DEGs的GO富集分析 通過GO富集分析對DEGs進(jìn)行BP、CC、MF富集(圖3)。主要參與B細(xì)胞激活、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞激活的正向調(diào)節(jié)信號通路等GO生物過程;并在免疫球蛋白復(fù)合體和免疫球蛋白復(fù)合體循環(huán)等細(xì)胞組分的構(gòu)成方面起作用;參與抗原結(jié)合和免疫球蛋白受體結(jié)合等分子功能。提示免疫系統(tǒng)在HST脅迫下發(fā)生了重要變化。

圖3 DEGs的GO注釋圖

2.3DEGs的KEGG富集分析 在HST脅迫下得到DEGs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),主要參與T、B細(xì)胞受體,PI3K-Akt,MAPK,NF-κB等多個免疫炎癥相關(guān)信號通路調(diào)控,見圖4。

圖4 DEGs的KEGG通路富集

2.4RT-qPCR驗證結(jié)果 對T、B細(xì)胞受體信號通路中的DEGs及相關(guān)炎癥因子進(jìn)行了mRNA表達(dá)量的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞表面膜分子:PD-1、CTLA4、CD45、CD4、CD8a、CD8b1、CD3e、ICOS、CD28、CD40L在PSC組與HST組之間均表現(xiàn)出顯著上調(diào)差異表達(dá);B細(xì)胞表面膜分子:PIR-B、CD22、CD72、Igα、Igβ、FcgRIIB、LEU13、CD81、CD19、CD21均表現(xiàn)出顯著差異變化;T、B細(xì)胞受體信號通路共有基因:PI3K-Akt途徑中PI3K、Akt、GSK-3β、NIK、IKKα基因,p38 MAPK和NF-κB途徑中SHP1、GRB2、SOS、Ras、Raf、MEK1/2、p38、NF-κB、IκB基因均出現(xiàn)差異表達(dá)。此外,相比于PSC組,HST組的INF-γ和TNF-α等炎性細(xì)胞因子出現(xiàn)顯著上調(diào)差異表達(dá)。因此,上述結(jié)果提示,在HST脅迫下通過影響T、B細(xì)胞受體信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。見圖5。

注:A.T細(xì)胞表面膜分子;B.B細(xì)胞表面膜分子;C.T、B細(xì)胞受體信號通路共有基因。與PSC組相比,aP<0.000 1,bP<0.05,cP<0.001,dP<0.01。

3 討 論

經(jīng)過30 d HST暴露后,發(fā)現(xiàn)HST組相較于PSC組小鼠脾臟組織多個基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn),缺氧抑制白細(xì)胞介素-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖過程,同時抑制抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。據(jù)報道,低氧暴露會引起機(jī)體對傷害性刺激做出防御性反應(yīng),在免疫應(yīng)答過程中,免疫細(xì)胞被激活、分裂和分化,通過誘導(dǎo)炎癥消除危險信號以保護(hù)機(jī)體免受傷害[13]。本研究通過比較暴露于不同海拔的小鼠脾臟組織轉(zhuǎn)錄組譜,探討低氧對小鼠T、B細(xì)胞信號通路的影響機(jī)制。

為了解HST脅迫對小鼠脾臟T細(xì)胞膜受體激活機(jī)制,本實驗對T細(xì)胞膜受體的10個基因進(jìn)行RT-qPCR實驗驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因均出現(xiàn)了顯著性上調(diào)變化(圖5),提示TCR識別活化信號后,經(jīng)CD3和共受體CD4或CD8傳遞T細(xì)胞活化的第一信號,啟動T細(xì)胞激活,其次CD28、ICOS、CD40L共刺激分子相互作用下提供第二信號誘導(dǎo)T細(xì)胞完全活化,共抑制分子PD-1和CTLA4基因表達(dá)也顯著上調(diào),提示機(jī)體同時啟動免疫抑制信號,下調(diào)或中止了免疫應(yīng)答。

此外,HST脅迫對小鼠脾臟B細(xì)胞膜受體的激活與T細(xì)胞相似,也需要雙信號活化。BURROWS等[14]研究發(fā)現(xiàn)小鼠B細(xì)胞中HIF-1α激活后,BCR編輯減少和未成熟B細(xì)胞的發(fā)育停止,導(dǎo)致外周B細(xì)胞數(shù)量減少,HIF-1α的動態(tài)調(diào)節(jié)對正常的B細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),B細(xì)胞膜受體中的Igα、Igβ、CD19、CD21、CD81基因顯著下調(diào),提示激活BCR后,與Igα/β胞內(nèi)區(qū)相關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶LYN活化,使Igα/β、CD19/CD21/CD81胞內(nèi)段的ITAM酪氨酸殘基被磷酸化后發(fā)生負(fù)調(diào)節(jié),隨后募集并活化SYK,進(jìn)而啟動B細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)。

T、B細(xì)胞受體信號通路參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞生長、凋亡等生物事件的發(fā)生。為了進(jìn)一步明確HST脅迫對小鼠脾臟T、B細(xì)胞內(nèi)信號通路影響的機(jī)制,對T、B細(xì)胞受體信號通路中的DEGs進(jìn)行了分析,提示低氧激活T、B細(xì)胞,啟動信號級聯(lián)反應(yīng)將活化信號轉(zhuǎn)入T、B細(xì)胞內(nèi),一方面活化信號激活PI3K后,催化PIP2的3位羥基磷酸化生成PIP3為第二信使,招募PDK1和Akt到質(zhì)膜上,磷酸化Akt蛋白的第308號蘇氨酸,導(dǎo)致Akt活化,進(jìn)一步激活下游GSK-3β和IKKα。Akt磷酸化GSK3β后,導(dǎo)致β-catenin在胞漿內(nèi)大量聚集,進(jìn)入細(xì)胞核激活T、B細(xì)胞分裂、生長調(diào)控及炎癥相關(guān)基因(如IFN-γ、TNF-α等);IKKα被Akt磷酸化激活后,IKKα進(jìn)一步磷酸化能夠抑制NF-κB途徑的轉(zhuǎn)錄因子IκB。以上結(jié)果提示,HST脅迫引起PI3K-Akt信號軸激活,導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)和炎癥因子的產(chǎn)生(如IFN-γ、TNF-α等)。有研究表明,PI3K-Akt是各種細(xì)胞表面受體激活的脂質(zhì)激酶家族,PI3K-Akt可以控制T、B細(xì)胞從淋巴結(jié)的進(jìn)出,以及炎癥組織中T、B細(xì)胞的招募和擴(kuò)增[15]。據(jù)報道,HST暴露的大鼠腦組織中HIF、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、PI3K和Akt的磷酸化顯著增強(qiáng),激活大鼠腦組織中PI3K-Akt信號通路,參與腦組織炎癥損傷和凋亡[16]。有研究發(fā)現(xiàn),PI3K-Akt和HIF-1α通路是介導(dǎo)小鼠卵巢癌的關(guān)鍵致癌通路,其中,鹽誘導(dǎo)激酶2(SIK2)可以激活PI3K-Akt、HIF-1α和線粒體動力相關(guān)蛋白1(Drp1)磷酸化引起線粒體裂變,導(dǎo)致免疫平衡失調(diào),進(jìn)而誘發(fā)癌癥[17]。此外,有研究報道,IFN-γ刺激促炎巨噬細(xì)胞的活化,抑制腫瘤組織中的血管生成,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡,進(jìn)而克服腫瘤的進(jìn)展[18]。同時,慢性炎癥與TNF-α的過度激活密切相關(guān),并最終可能導(dǎo)致自身免疫性疾病[19]。結(jié)合以上研究結(jié)果,HST脅迫通過激活T、B細(xì)胞受體信號通路內(nèi)PI3K-Akt信號途徑,促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的成熟和分泌,從而發(fā)揮炎癥和免疫效應(yīng)。

另一方面活化信號轉(zhuǎn)入T、B細(xì)胞內(nèi),通過抑制性共受體(PIR-B、CD22、CD72)向免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)招募磷酶來負(fù)調(diào)節(jié)BCR信號傳導(dǎo),抑制SHP1基因表達(dá),進(jìn)一步磷酸化SOS和Ras,導(dǎo)致MEK1/2、p38、NFKB基因顯著下調(diào),抑制p38 MAPK和NF-κB信號通路,對免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用,從而在清除抗原的同時保持機(jī)體的免疫平衡。如,ZHU等[20]研究發(fā)現(xiàn),通過抑制缺血缺氧性腦損傷(HIBI)模型大鼠的p38 MAPK信號通路,減少海馬組織中的神經(jīng)元凋亡,從而提高HIBI大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和運動功能。KAUPPINEN等[21]研究還發(fā)現(xiàn),NF-κB信號傳導(dǎo)在固有免疫防御中起著重要作用,通過激活沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT1)可抑制NF-κB信號傳導(dǎo),發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗損傷,維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。此外,有報道稱,異丙酚通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號通路來減少炎癥因子的釋放并緩解腸道水腫,從而減輕和治療大鼠的腸道缺血/再灌注損傷[22]。牛磺酸通過下調(diào)p38 MAPK和NF-κB信號通路,抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,從而緩解肺損傷,恢復(fù)呼吸功能并降低炎癥因子水平[23]。結(jié)合上述研究提示,30 d HST暴露小鼠通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號途徑,引起T、B細(xì)胞受體信號通路有效地執(zhí)行宿主防御響應(yīng)的分子機(jī)制[24-25]。

T、B細(xì)胞受體信號通路是復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)。因此,本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對T、B細(xì)胞受體信號通路相關(guān)基因進(jìn)行分析和RT-qPCR的驗證。本實驗發(fā)現(xiàn),T、B細(xì)胞受體信號通路中顯著性DEGs在PI3K-Akt、p38 MAPK和NF-κB通路中。結(jié)果提示,HST脅迫通過激活PI3K-Akt通路,抑制p38 MAPK和NF-κB通路,誘導(dǎo)脾臟組織T、B細(xì)胞受體信號通路發(fā)生改變,致使機(jī)體內(nèi)部免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此,這一結(jié)果將為研究HST對小鼠T、B淋巴細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制提供新的見解,也為高原醫(yī)學(xué)在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。