2型糖尿病患者血漿miR-146a和miR-223的表達研究

楊喜永,徐雪勤,張愛榮,趙小燕,代建宇,鄭錫銘

(駐馬店市中心醫院:1.檢驗科;2.內分泌科,河南 駐馬店 463000)

2型糖尿病(T2DM)是一種慢性自身性免疫代謝性疾病,隨著經濟的發展和物質生活水平的提升,近年發病率越來越高。目前,糖尿病已成為我國主要的公共衛生問題之一[1-2]。T2DM是一組以胰島素抵抗和胰島素敏感性下降導致高血糖水平為特征的代謝綜合征,在疾病的發生、發展過程中多有遺傳因素、環境多因素的參與,綜合病因錯綜復雜,同時多伴胰島β細胞功能衰退和胰島素抵抗。同時,隨著病情的進展,高血糖可帶來包括心臟病、腦卒中、糖尿病視網膜病變、腎臟衰竭,甚至四肢血流不暢而需要截肢等嚴重的并發癥[3]。

miRNA作為內源性的非編碼的微小RNA,可以通過作用于特異性序列抑制靶基因轉錄、在翻譯后水平來調控機體蛋白表達,參與多種炎性和自身免疫性疾病的發病過程[4]。有研究表明,在T2DM患者外周血中存在差異表達的miRNA[5-6],這些差異表達的miRNA提示其可能作為T2DM患者一種潛在的生物學診斷標志物[7]。由于T2DM為非胰島素依賴型糖尿病,常起病隱匿,病程持續時間長,在早期多無典型的臨床表現,如能在機體出現血糖代謝異常的早期和糖尿病前期及時進行飲食干預或藥物治療,可以極大地改善患者胰島功能,減少患者對胰島素的抵抗,從而延緩T2DM的發生、發展進程,所以尋找一種特異性的生物學標志物對T2DM的早期診斷具有重要的臨床意義[2]。本研究通過檢測miR-146a和miR-223在60例健康對照組及126例T2DM患者血漿中的表達水平,以探討二者對T2DM患者的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月本院住院的T2DM患者126例作為T2DM組,診斷均符合《中國2 型糖尿病防治指南》中T2DM的診斷標準[8],其中男66例,女60例;年齡14～78歲,平均(47.63±9.36)歲。另選取在本院體檢中心同期進行健康體檢者60例作為健康對照組,其中男30例,女30例;年齡16～75歲,平均(46.21±8.13)歲。選取的研究對象均排除其他可能影響機體miRNA表達的疾病及異常情況,同時本組研究獲得醫院醫學倫理委員會的批準,所有參與者均知情同意。

1.2儀器與試劑

1.2.1實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 所有受試者入組后均采集乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血3 mL,3 000 r/min離心10 min,取上層血漿置于-80 ℃冰箱備用。使用Small RNA提取試劑盒經反轉錄合成cDNA后保存備用。按照qRT-PCR熒光定量試劑盒操作說明進行熒光定量檢測,設置平行復孔,檢測結果取平均值。

1.2.2常規生化指標檢測方法 記錄2組受試者身高、體重,計算體重指數(BMI)。入院空腹8～12 h于次日晨抽取肘靜脈血3 mL檢測,采用貝克曼Au-5800全自動生化分析儀檢測靜脈血空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的表達水平,以上所有檢測操作嚴格按照檢測儀器及配套試劑檢測說明書進行。

2 結 果

2.12組受試者一般情況及常規生化指標比較 T2DM組患者BMI、TG、TC、LDL-C、FPG 和HbA1c均高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05);2組患者年齡、HDL-C比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組受試者一般情況及常規生化指標比較

2.2血漿miR-146a及miR-223的表達分析 與健康對照組相比,血漿miR-146a在T2DM組患者中的表達量明顯升高,而血漿中miR-223的表達量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組受試者血漿miR-146a及miR-223表達量比較

2.3血漿miR-146a、miR-223與T2DM患者臨床常見監測指標的相關性分析 Pearson相關分析顯示,miR-146a和miR-223在T2DM患者血漿中存在一定的正相關關系(r=0.445,P<0.05)。miR-146a與病程、TG、TC、LDL-C和FPG 呈正相關(r=0.597、0.656、0.676、0.773、0.735,P<0.05);與BMI、HDL-C和HbA1c無相關性(P>0.05)。miR-223與病程呈正相關(r=0.482,P<0.05),與TG、TC、LDL-C和FPG 呈負相關(r=-0.545、-0.735、-0.831、-0.565,P<0.05),與BMI、HDL-C和HbA1c無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 血漿miR-146a、miR-223與T2DM患者臨床指標相關性分析

2.4血漿miR-146a及miR-223的ROC曲線分析 為評估患者血漿miR-146a及miR-223對T2DM患者的診斷價值,對其血漿miR-146a及miR-223表達量進行ROC曲線分析,結果見表4。血漿miR-146a cutoff值為5.85×109時,診斷靈敏度為72.5%,特異度為73.3%;血漿miR-223 cutoff值為9.26×107時,診斷靈敏度為70.0%,特異度為80.0%;血漿miR-146a聯合miR-223檢測診斷靈敏度和特異度分別為85.8%、83.3%,見圖1。

圖1 血漿miR-146a、miR-223 ROC曲線

表4 T2DM患者血漿miR-146a、miR-223的ROC曲線分析

3 討 論

T2DM是一組以胰島β細胞功能衰退和胰島素抵抗為主要病理生理特征的高血糖代謝綜合征。在T2DM發病過程中可出現miRNA的表達失調,異常表達的miRNA通過影響患者機體對胰島素的敏感性、胰島素的產生與分泌、胰島β細胞的發育和胰島素信號傳導途徑,繼而改變葡萄糖代謝過程,導致機體產生胰島素抵抗和T2DM的發生、發展[2,9]。同時T2DM 的發病與機體炎癥因子的異常表達密切相關,不同的炎癥因子能夠通過多條信號通路誘導胰島細胞結構與功能的變化,促進機體胰島素抵抗,進而誘導T2DM的發病[10]。

miR-146a通過Toll樣受體信號和細胞因子反應來調節先天性免疫反應,與諸多慢性炎癥性疾病密切相關[11]。各種導致核因子-κB(NF-κB)活化的途徑均可引起胰島β細胞凋亡,而miR-146a對炎癥因子的轉錄調控依賴于NF-κB的活化,因而可推測miR-146a參與胰島β細胞凋亡[12-13]。ROGGLI等[14]對炎癥介導的胰島β細胞凋亡過程中miRNA進行研究發現,miR-146a在胰島組織中的表達水平上升,因此miR-146a與胰島β細胞的凋亡關系密切。胰島素抵抗是T2DM發病的基礎病理機制,研究表明,白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等多種細胞因子參與了T2DM慢性炎癥過程,使外周胰島素靶器官對胰島素的敏感性下降,產生胰島素抵抗[15]。慢性炎癥反應激活Toll樣受體信號通路可導致miR-146a的表達上調,上調的miR-146a又可以通過抑制IRAKl和TRAF6來調控多種炎癥因子引起的胰島素抵抗和胰島素分泌不足,從而通過負反饋調節通路影響糖尿病的發生和發展[16]。本研究數據顯示,血漿miR-146a在T2DM患者中的表達量高于健康人群。

既往研究顯示,miR-223與糖尿病的發生、發展及炎癥因子的表達有著密切聯系。miR-223靶基因主要存在于胞漿和核漿中,可以參與細胞對胰島素刺激的反應,miR-223可通過PRKACB調控胰島素分泌[17]。miR-223的表達和炎癥因子的表達呈負相關,miR-223 表達的下調能夠激活NF-κB信號通路,促進炎癥因子的表達,形成慢性炎癥反應,引起胰島素抵抗和胰島素分泌。ZAMPETAKI等[18]研究發現,在T2DM患者中miR-223的表達水平降低,徐菁等[19]研究發現在肥胖與妊娠糖尿病孕婦外周血中miR-223與miR-155的表達水平顯著降低。LU等[20]研究表明,miR-223在T2DM患者血清中的表達顯著降低,其在心肌細胞與脂肪細胞中可以靶向調控通過葡萄糖轉運體4(GLUT4)調節心肌細胞葡萄糖的代謝。本組研究數據顯示,血漿miR-223在T2DM患者中的表達量顯著低于對照組,與上述報道數據一致。

對于T2DM患者,血脂、血糖的異常在疾病的發生、發展過程中發揮著重要的致病作用。有研究表明,HbA1c水平越高,受檢者靜脈血FPG、TG、TC、LDL-C水平也會更高,HDL-C則更低,這主要是由于HbA1c是紅細胞中血紅蛋白與血清中糖類相結合所得的產物,若受檢者長期處于血糖較高狀態,則會導致HbA1c的生成,致其糖化水平顯著上升[21]。同時,由于胰島素對TG與糖間的轉變有抑制、促進作用,因而若胰島素分泌過少或生理功能受損,則會影響TG轉變為葡萄糖,同時人體內葡萄糖含量、血糖檢測值過高,則同樣會抑制TG的轉變,進而導致受檢者出現TG、TC、LDL-C水平升高,HDL-C水平下降等癥狀。對本研究檢測數據進行相關性分析顯示,血漿miR-146a的表達水平與患者的病程及患者TG、TC、LDL-C和FPG的表達水平呈正相關,與BMI、HDL-C和HbA1c的表達無相關性。血漿miR-223的表達水平與患者病程呈正相關,與患者血漿TG、TC、LDL-C和FPG的表達水平呈負相關,與BMI、HDL-C和HbA1c無相關性。提示患者血漿miR-146a、miR-223參與T2DM的發病進程。

同時,本組研究還發現,血漿miR-146a和miR-223在T2DM的診斷中具有高靈敏度和特異度。血漿miR-146a診斷AUC為0.792,當診斷臨界值為5.85×109時其診斷靈敏度和特異度分別為72.5%和73.3%。血漿miR-223診斷AUC為0.832,當診斷臨界值為9.26×107時其診斷靈敏度和特異度分別為70.0%和80.0%;聯合檢測診斷AUC為0.917,其診斷靈敏度和特異度分別為85.8%和83.3%,以上結果表明血漿miR-146a和miR-223的表達水平可以作為T2DM臨床診斷的潛在生物學標志物,但是因為本研究樣本檢測的數量限制和地域性限制,還需要對上述結果進一步進行大樣本量的驗證。總之,本研究數據表明,T2DM患者血漿miR-146a和miR-223表達存在顯著差異,可以作為臨床診斷T2DM的一種新的潛在生物學標志物。