HPLC法測(cè)定加味甘露消毒丹中大黃素的含量

劉永謙 廖馨然 劉付偉清 王濤

1廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣州 511442；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；3廣東省婦幼保健院婦科，廣州 511442

甘露消毒丹，又名普濟(jì)消毒丹，由清代葉天士所創(chuàng)，始載于《醫(yī)效秘傳·卷一》，由滑石、茵陳、黃芩等藥味組成的溫病名方，主治濕溫時(shí)疫、濕熱并重等癥，臨床上用于手足口病、肝炎、流感、腮腺炎等治療。許多研究表明，加減甘露消毒丹對(duì)手足口病具有較好的臨床療效，可有效改善患兒的臨床癥狀，并在人體內(nèi)具有較好的抗病毒作用［1-15］。其已在廣東省婦幼保健院作為常規(guī)手足口病治療的臨床方加以廣泛應(yīng)用。常用的加味甘露消毒丹是在此方的基礎(chǔ)上略作調(diào)整，去除石菖蒲、木通，另外加入通草、柴胡、僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃等藥味，且重用了大黃。大黃素是一種蒽醌類衍生物，化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，是中藥大黃的主要有效單體［16］。有大量研究結(jié)果表明，大黃素對(duì)EB病毒、乙肝病毒、巨細(xì)胞病毒、冠狀病毒等有抑制作用，有證據(jù)表明其也具有殺病毒效應(yīng)［17-28］。另有研究表明，大黃素通過(guò)抑制TLR3途徑，在通過(guò)CVB3介導(dǎo)的手足口病引起的腦炎中發(fā)揮保護(hù)作用［29］。

為有效地控制藥品質(zhì)量和保證用藥安全，本研究以具有抗病毒作用的大黃素作為質(zhì)量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定加味甘露消毒丹中大黃素的含量，用于該方的質(zhì)量控制，擬為該經(jīng)典方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

材 料

1.實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀、SHIMADZU AUY120型電子天平（島津企業(yè)管理有限公司）、Precisa EP225SM-DR微量雙量程電子分析天平（普利賽斯稱重設(shè)備有限公司）。

2.實(shí)驗(yàn)試藥

甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。大黃素（含量測(cè)定用，批號(hào)C10217232，純度≥98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，組方中浙貝母（批號(hào)：191205901）、滑石（批號(hào)：191001761）、姜黃（批號(hào)：190901001）、僵蠶（批號(hào)：191100119）、蟬蛻（批號(hào)：190704961）、黃芩片（批號(hào)：191001021）、通草（批號(hào)：190901061）、茵陳（批號(hào)：190902571）、廣藿香（批號(hào)：191000991）、大黃（批號(hào)1：190800099，批號(hào)2：200300059，批號(hào)3：200100011）、薄荷（批號(hào)：190901101）均購(gòu)于康美藥業(yè)股份有限公司，連翹（批號(hào)：1909001）、北柴胡（批號(hào)：2009001）、射干（批號(hào)：2003001）、白蔻仁（批號(hào)：2003001）均購(gòu)于嶺南中藥飲片有限公司。

方法與結(jié)果

1.對(duì)照品儲(chǔ)備液和溶液的制備

精密稱定大黃素對(duì)照品，加甲醇超聲（功率為150 W，頻率為40 kHz）溶解，制成1 ml含80.00 μg大黃素的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取10 ml上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于100 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度即得1 ml含8.000 μg大黃素的對(duì)照品溶液。對(duì)照品儲(chǔ)備液及對(duì)照品溶液均保存于2～8 ℃冰箱中備用。

2.供試品溶液的制備

取加味甘露消毒丹方內(nèi)各藥，按組方單味藥及取樣量分別稱取浙貝母、滑石、姜黃等前10種單味藥，精密稱定，置250 ml圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，加熱回流1 h，再加入茵陳、廣藿香、大黃、薄荷、白蔻仁5種后下藥，繼續(xù)加熱回流10 min，放冷，濾過(guò)。精確吸取20～50 ml續(xù)濾液，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理1 min，加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用三氯甲烷洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層。酸液用10 ml三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液至100 ml圓底燒瓶，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0%乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3.陰性樣品溶液的制備

根據(jù)加味甘露消毒丹的處方和工藝，準(zhǔn)備缺大黃藥材的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法同法制備缺大黃的陰性樣品溶液。

4.色譜條件［30］

色譜柱：Agilent ZORMAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），根據(jù)表1進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣時(shí)間：15 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序（%）

5.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“4”項(xiàng)色譜條件下，依次進(jìn)樣對(duì)照品溶液（4.000 mg/L）、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，理論塔板數(shù)按大黃素計(jì)算不低于3 000，目標(biāo)峰與其相鄰峰的分離度大于1.5，分離完全，大黃素的測(cè)定不受其他組分的干擾。陰性樣品中，在大黃素的保留時(shí)間處無(wú)吸收峰，表明此方法專屬性良好。

圖1 大黃素對(duì)照品（A）、供試品溶液（B）、陰性樣品溶液（C）的高效液相色譜圖

6.線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.5 ml、4.0 ml、5.0 ml、7.5 ml、10.0 ml對(duì)照品溶液，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度，制得每1 ml含大黃素分別為2.000、3.200、4.000、6.000、8.000 μg系列濃度對(duì)照品溶液。精密吸取制得的對(duì)照品溶液，在“4”項(xiàng)下的色譜條件下，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、大黃素濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到大黃素的線性回歸方程為Y=223.93X+10.85，R2=0.999 8，即大黃素在濃度為2.000～8.000 mg/L的濃度范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積呈良好線性關(guān)系。

7.精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液和溶液制備項(xiàng)下的8 mg/L對(duì)照品溶液，在“4”項(xiàng)的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），結(jié)果顯示大黃素峰面積的RSD（n=6）為0.13%，表明實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

8.重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)試藥項(xiàng)下的批號(hào)和取樣量，取同一批號(hào)的大黃組方進(jìn)行試驗(yàn)（批號(hào)190800099，S1），分別按供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，在“4”項(xiàng)的色譜條件下，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算平均含量和RSD，結(jié)果顯示大黃素的平均含量（n=6）為14.23 mg/L，RSD為2.59%，表明本實(shí)驗(yàn)所用方法重復(fù)性良好。

9.穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份供試品溶液，在“4”項(xiàng)的色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD為2.20%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

10.加樣回收率試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)試藥項(xiàng)下的批號(hào)和取樣量，取同一批號(hào)的大黃進(jìn)行試驗(yàn)（批號(hào)190800099，S1），精密移取4.5 ml對(duì)照品溶液，置于250 ml圓底燒瓶中，分別按供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，在“4”項(xiàng)的色譜條件下，進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2，表明本實(shí)驗(yàn)所用方法加樣回收率好，適用于加味甘露消毒丹中大黃素的測(cè)定。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

11.樣品含量測(cè)定

以實(shí)驗(yàn)試藥項(xiàng)下的批號(hào)和取樣量，按供試品溶液制備下的方法制備供試品溶液，在“4”項(xiàng)的色譜條件下，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程，用外標(biāo)法計(jì)算大黃素的含量，結(jié)果參見(jiàn)表3。

表3 加味甘露消毒丹中大黃素的含量（n=3）

結(jié) 論

參考文獻(xiàn)及藥典中有關(guān)大黃素測(cè)定波長(zhǎng)的報(bào)道，因其在254 nm處有最大吸收，故而本復(fù)方中大黃素的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為254 nm。洗脫劑系統(tǒng)是影響其含量測(cè)定的關(guān)鍵因素之一。洗脫劑系統(tǒng)首先嘗試了藥典甲醇-0.1%磷酸溶液的體系，但本復(fù)方中藥味多，干擾成分比較多，在等度洗脫的條件下易導(dǎo)致其他成分對(duì)大黃素測(cè)定的干擾，分離度不符合要求，經(jīng)過(guò)梯度法變更流動(dòng)相比例后，恰好使大黃素和其他化學(xué)成分有效分離，而且峰形對(duì)稱。

樣品的提取方法是影響其含量測(cè)定的另一關(guān)鍵因素。供試品溶液制備時(shí)，曾考察超聲和回流兩種提取方式的差異，發(fā)現(xiàn)回流方式對(duì)復(fù)方中化學(xué)成分的提取效率更佳，故確定了超聲的提取法。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)加味甘露消毒丹中的大黃素進(jìn)行了含量測(cè)定，使用方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠，分離效果理想，重復(fù)性良好，可用于加味甘露消毒丹的質(zhì)量控制，并為該經(jīng)典復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供數(shù)據(jù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉永謙：提出研究選題，設(shè)計(jì)研究方案，查閱文獻(xiàn)，修訂論文；廖馨然：查閱文獻(xiàn)，試驗(yàn)操作，起草論文；劉付偉清：查閱文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分析；王濤：提出研究選題，設(shè)計(jì)研究方案，查閱文獻(xiàn)，修訂論文，指導(dǎo)性支持