一種新型熒光納米材料的化學合成與臨床效果分析

鐘國華,廖繼梅,彭方毅,姜海蓉,鐘詩淇

(1.重慶市奉節縣興隆鎮中心衛生院,重慶 404604;2.重慶萊博科醫學檢驗實驗室,重慶 40003;3.重慶市公共衛生醫療救治中心,重慶 400030;4.西南大學,重慶 400715)

尿酸作為人體重要的一種代謝物,其在血清中的含量是反映人們身體情況的重要指標。關于血清中尿酸含量的檢測,部分學者也進行了很多研究,如制備了海藻酸鈉-銀納米粒功能探針,用于尿酸的檢測,結果表明:該比色探針環保,制備簡單,特異性強,穩定性好,有望為尿酸臨床相關疾病的生化診斷提供一種新的檢測方法[1]。通過rGO/GCE修飾電極對尿酸進行測試,結果表明:rGO/GCE修飾電極對尿酸的電催化氧化有明顯增強作用,表現出較好的檢測效果[2]。使用電化學法對血清中尿酸含量進行分析,但由于生物樣品中尿酸和多巴胺的氧化電位相近,容易出現干擾的情況,使得檢測結果存在一定的誤差[3]。利用碳量子點(CDs)還原Ag離子,得到核殼結構的Ag-CDs納米粒子,并以此為SERS基底,通過SERS光譜對尿酸濃度進行檢測[4]。建立了以紙芯片為分析平臺的尿酸含量快速檢測方法,并對其檢測效果進行研究,結果表明:該方法用于血清中尿酸檢測時,表現出良好的檢測效果,且15種共存物質在允許誤差范圍內均無干擾,可用于血清中尿酸含量檢測[5]?；诖?本試驗以文獻[6]的方法為參考,制備了一種新型熒光納米材料用于血清中尿酸的檢測。

1 試驗部分

1.1 材料與設備

主要材料:魯米諾(AR),博杰生物科技;硝酸鋱(AR),中航新材料;醋酸-醋酸鈉緩沖液(AR),尚寶生物科技);尿酸標液(AR),信康醫藥化工。

主要設備:VORTEX-6型渦旋振蕩器(歐萊博技術);SNE-3200M型掃描電鏡(武訓科技);HT7800型透射電鏡(莊潤國際貿易);F-380型熒光發光光譜儀(今時邁科技)。

1.2 化學合成方法

1.2.1熒光納米材料的制備

(1)將一定量魯米諾固體放入燒杯中,然后逐步加入濃度為0.2 mol/L氫氧化鈉溶液,添加量為剛好溶解魯米諾固體,然后通過超純水將魯米諾溶液稀釋至指定的濃度體積;

(2)將10 μL濃度為0.025 mmol/L魯米諾溶液和50 μL濃度為0.125 mmol/L的硝酸鋱溶液混合反應10 min,得到熒光納米材料。

1.2.2尿酸的檢測

在熒光納米材料中依次放入200 μL濃度為0.2 mol/L,一定pH值的緩沖溶液、不同濃度的尿酸,并用超純水將溶液體積定容至1 mL左右,設置好反應溫度后,在VORTEX-6型渦旋振蕩器的作用下進行充分混合反應一段時間,然后對熒光信號進行檢測。

1.3 性能測試

1.3.1微觀結構表征

通過SNE-3200M型掃描電鏡和HT7800型透射電鏡對熒光納米材料的微觀形貌結構進行表征。

1.3.2熒光強度測試

通過熒光發光光譜儀測試材料的熒光強度。

熒光強度猝滅率表達式[7-8]:

δ=(I0-I)/I0×100%

(1)

式中:δ為熒光強度猝滅率,%;I0、I分別為未添加、添加了尿酸的熒光納米材料的熒光信號強度,a.u.。

1.3.3線性關系確定

對添加了不同濃度尿酸的熒光納米材料熒光強度進行測試,確定方法的標準曲線。以空白樣品熒光強度檢測值的3倍作為方法檢測限。

1.3.4選擇性分析

在熒光納米材料中分別放入尿酸、常見金屬陽離子和小分子,觀察不同離子和分子對熒光納米材料熒光強度猝滅率的影響。

1.3.5實際樣品檢測

在實際樣品中添加不同濃度的尿酸標準溶液,通過實際樣品的平均加標回收率表征熒光納米材料用于尿酸檢測的可行性。

2 結果與討論

2.1 熒光納米材料表征

2.1.1熒光效果分析

對納米材料熒光效果進行分析,結果如圖1所示。

圖1 熒光發射光譜圖

由圖1可知,在激發波長為290 nm的條件下,魯米諾溶液的最大發射波長為430 nm,溶液發出微弱藍色熒光。相同激發波長條件下,熒光納米材料熒光強度達到了魯米諾溶液的40倍,溶液發出較強的藍色熒光。這說明魯米諾顆粒聚集后,在聚集誘導發光的作用下,使得納米熒光材料表現出較好的熒光強度[9-10]。在納米熒光材料中加入50 μL尿酸溶液后,熒光納米材料熒光強度被猝滅了約31.4%,這說明尿酸與納米熒光材料間存在光誘導電子轉移,使得納米熒光材料熒光強度被猝滅,出現較明顯的信號變化[11]。以上變化說明了通過熒光納米材料檢測尿酸是可行的。

2.1.2光穩定性試驗

圖2為光穩定性測試結果。

圖2 光穩定性試驗結果

由圖2可知,經過42 d冷凍放置后,熒光材料的熒光信號不發生改變,表現出良好的光穩定性。

2.2 尿酸檢測條件優化

2.2.1試驗溫度優化

對尿酸檢測溫度進行優化,結果如圖3所示。I0和I分別為未添加和添加了尿酸的熒光納米材料的熒光信號強度。

圖3 試驗溫度優化結果

由圖3可知,試驗溫度對熒光納米材料檢測尿酸的影響不大,在所有溫度條件下,熒光納米材料熒光強度猝滅率均穩定在90%左右。為了避免高溫對后續試驗產生影響,因此選擇適合的試驗溫度為15 ℃。

2.2.2反應時間優化

圖4為反應時間優化結果。

圖4 反應時間優化結果

由圖4可知,反應進行2 min后,熒光強度趨于穩定。這說明反應時間達到2 min后,尿酸對熒光納米材料的熒光強度猝滅值達到穩定狀態,即熒光納米材料與尿酸的反應是快速且穩定的,可以通過該熒光納米材料快速檢測尿酸[12-13]。為了得到穩定的試驗數據,避免時間的浪費,選擇適合的反應時間為2 min。

2.2.3緩沖溶液的選擇及pH值優化

選擇2種不同種類和不同pH值的緩沖液進行試驗,觀察不同反應條件下,熒光納米材料檢測尿酸熒光強度猝滅率的變化,結果如圖5所示。

(a)醋酸-醋酸鈉緩沖液

由圖5(a)可知,選擇醋酸-醋酸鈉緩沖液時,熒光納米材料猝滅率隨pH值的增加而增加,當醋酸-醋酸鈉緩沖液pH值達到7.0時,熒光納米材料熒光強度的猝滅率達到90%以上,表現出良好的猝滅效果。由于醋酸-醋酸鈉緩沖液的有效緩沖范圍均為酸性環境,因此以Tris-HCl 緩沖溶液為對照,觀察堿性環境下,熒光納米材料的熒光強度猝滅率變化情況。由圖5(b)可知,選擇Tris-HCl 緩沖溶液進行試驗時,熒光猝滅率在pH值為7.1時達到最高60%。結合圖5(a)和圖5(b)可知,2種緩沖液的最佳pH值均為中性環境,且在醋酸-醋酸鈉緩沖液條件下,尿酸對熒光納米材料的熒光猝滅率更高。因此,選擇pH值為7的醋酸-醋酸鈉緩沖液繼續試驗。

2.3 尿酸檢測效果分析

2.3.1檢測靈敏度分析

通過對不同濃度尿酸進行測試,記錄在激發波長為290 nm條件下,最大發射波長430 nm處熒光納米材料的熒光強度猝滅率,結果如圖6所示。

圖6 線性曲線

由圖6可知,隨尿酸濃度的增加,尿酸對熒光納米材料熒光強度猝滅率也明顯增加,兩者間表現出良好的線性關系。在濃度為0.1～50 μmol/L時,R2為0.99,檢測限(LOD)為28 nmol/L,表現出良好的檢測效果。

表1為方法靈敏度試驗結果。

表1 與其他方法對比Tab.1 Comparison with other methods

由表1可知,本試驗構建的熒光猝滅法檢測尿酸的檢測限明顯低于其他檢測方法,表現出較好的靈敏度。

2.3.2 選擇性分析

圖7為選擇性試驗結果。

圖7 選擇性試驗結果

由圖7可知,尿酸對熒光納米材料的猝滅率超過了90%,表現出較好的猝滅效果。其余金屬陽離子和小分子對熒光納米材料的猝滅率均小于5%,猝滅效果可忽略不計。這說明本試驗制備的熒光納米材料對尿酸的檢測表現出較好的選擇性[19]。

2.4 實際樣品分析

通過加標回收率試驗對血清樣品中的尿酸含量進行檢測,確定熒光納米材料用于血清中尿酸檢測的可行性,試驗結果如表2所示。

表2 加標回收率Tab.2 Recovery rate of spiking

由表2可知,在加標樣品濃度分別為5、15和30 μmol/L時,樣品平均加標回收率為98.2%～101.1%,相對標準偏差(RSD)均未超過3%,加標回收效果良好。這說明了本試驗制備的熒光納米材料可以用于血清中尿酸含量的檢測,且表現出良好的檢測效果[20]。

3 結語

(1)在鋱離子的作用下,魯米諾顆粒發生了聚集,熒光強度較未經過處理的魯米諾溶液增強了約40倍;

(2)尿酸與熒光納米材料發生反應后,熒光納米材料熒光強度猝滅率約為31.4%,表現出良好的猝滅效果;

(3)熒光納米材料與尿酸優化反應條件為,反應溫度15 ℃,反應時間2 min,反應環境pH值為7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液。在此條件下,尿酸對熒光納米材料熒光強度猝滅率超過90%;

(4)在濃度為0.1～50 μmol/L時,R2為0.99,LOD為28 nmol/L,檢測效果良好;

(5)與同類檢測方法進行對比,通過熒光納米材料檢測尿酸的檢測限明顯低于其他檢測方法,表現出較好的靈敏度;

(6)尿酸對熒光納米材料的猝滅率超過了90%,其余金屬陽離子和小分子對熒光納米材料的猝滅率均小于5%,表現出較好的選擇性;

(7)對實際樣品進行分析,在濃度為5～30 μmol/L加標內,樣品平均加標回收率為98.2%～101.1%,RSD不大于3%,表現出良好加標回收效果。