白鮮皮“異病同治”皮炎、濕疹和銀屑病的作用機制預測

鄧嘉林, 錢亞云, 楊妞妞, 2

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225009; 2. 揚州大學附屬醫院 中醫科, 江蘇 揚州, 225012)

皮炎、濕疹、銀屑病是臨床上常見的易反復發作的慢性炎癥性皮膚病,且都伴有一定程度的皮損。目前,臨床上常使用激素和免疫抑制劑類藥物進行治療,如皮質類固醇類藥物、抗組胺類藥物[1], 但治療成本高、易復發,且常伴有各種副作用[2]。激素類藥物可能導致機體代謝異常、肌無力、生長發育遲緩、誘發精神癥狀等結果[3], 免疫抑制劑可能會引起鼻咽炎、頭痛、肺結核、藥物性狼瘡、炎癥性腸病等不良反應[4]。中藥作為中國傳統醫學的瑰寶,長期被用于治療皮膚炎癥,具有配方靈活、成本低、療效穩定、副作用小等優點[5]。白鮮皮是蕓香科多年生草本植物白鮮的干燥根皮,具有清熱燥濕、祛風解毒的作用,臨床上主要用于治療皮膚炎癥、濕疹、風疹、風濕、婦科炎癥等疾病[6-8]。現代藥理學研究[9]發現,白鮮皮具有明顯的抗炎、殺蟲、免疫抑制等作用,但白鮮皮用于治療皮炎、濕疹、銀屑病的共同機制尚不清楚。本研究采用網絡藥理學聯合分子對接技術,探討白鮮皮“同病異治”皮炎、濕疹、銀屑病的作用機制,為后期實驗研究及臨床藥物的研發提供一定指導[10]。

1 資料與方法

1.1 白鮮皮有效成分的獲取和作用靶點的預測

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中檢索白鮮皮成分[11], 并以藥物生物口服利用度(OB)≥30%, 藥物相似性(DL)≥0.18作為有效成分篩選的標準[12]。將有效成分的SMILES號導入STP數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),查得其對應結構式,再進行靶點預測,選擇prob>0的靶點作為白鮮皮的潛在作用靶點[13], 再將所有作用靶點合并去重,最后使用Uniprot數據庫(http://www.Uniport.org/)對靶點基因的名稱進行標準化[14]。

1.2 皮炎、濕疹、銀屑病相關靶點的預測和相同靶點的獲得

運用TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(http://www.omim.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)數據庫,以“皮炎(dermatitis)”“濕疹(eczema)”“銀屑病(psoriasis)”為關鍵詞分別進行檢索,獲得作用于皮炎、濕疹、銀屑病的相關靶點,再將皮炎、濕疹、銀屑病的相關靶點分別導入Venny2.1.0在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/Venny/)獲得皮炎、濕疹、銀屑病的相同靶點。

1.3 白鮮皮-皮炎/濕疹/銀屑病的相同靶點的交集靶點的獲得及網絡圖繪制

將白鮮皮有效成分的作用靶點與皮炎、濕疹、銀屑病的共同靶點分別導入Venny平臺,繪制韋恩圖,得到白鮮皮-疾病共同靶點的交集靶點。運用Cytoscape3.8.2軟件構建白鮮皮有效成分與交集靶點的網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及分析

為了探索白鮮皮與皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點的交集靶點基因之間的相互作用,將交集靶點基因通過相互作用數據庫平臺STRING(https://cn.string-db.org/)進行蛋白相互作用查詢并構建PPI網絡,選擇物種為“人(Homo sapiens)”, 最高置信度為0.400, 剔除無相互聯系的節點,得到白鮮皮治療皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點的PPI網絡。利用Cytoscape3.8.2軟件對網絡進行拓撲分析,篩選出節點度值最大的10個靶點作為該機制的核心靶點,用于后續的分子對接。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

為了明確交集靶點蛋白在基因功能及信號通路中的作用,對交集靶點基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。運用R語言軟件編碼,使得交集靶點在Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html)進行GO富集分析和KEGG信號通路分析,并進行可視化處理[15]。

1.6 分子對接

從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載5個核心成分的mol2格式。將篩選出的核心靶點輸入RCSB Protein Data Bank(pdb)數據庫(https://www.rcsb.org), 查找相關蛋白結構,并根據蛋白結構的種屬、作用機制、是否存在突變氨基酸殘基、鏈數、分辨率和pH值、蛋白結構中的配體與目標化合物的結果相似度等6個條件篩選出最佳的蛋白結構[16]。篩選出來的蛋白結構借助Discovery Studio 2019 Client軟件提取出靶點基因原配體,并將其重新對接到靶點基因的活性口袋中,設置晶體結構中原配體構象的RMSD值為0, 計算對接后配體構象的RMSD值, RMSD值≤2.5×10-10m時,認為分子對接結果可靠,可以用于分子對接[17]。運用AutoDock Tools進行分子對接,獲得的結果借助Open Babel軟件轉換為pdb格式,最后再用PyMOL軟件對結果進行可視化處理。

2 結 果

2.1 白鮮皮有效成分和潛在作用靶點

在TCMSP數據庫共檢索到白鮮皮成分63個,有效成分18個,去除在STP數據庫中沒有預測靶點的成分,共篩選得到15個有效成分,合并刪重后共有447個潛在作用靶點。運用Uniprot數據庫規范化處理靶點基因名稱。15個有效成分見表1。

表1 白鮮皮的有效成分

2.2 皮炎、濕疹、銀屑病的共同靶點

以“皮炎(dermatitis)”“濕疹(eczema)”“銀屑病(psoriasis)”為關鍵詞,在TTD、OMIM、DrugBank、GeneCards、DisGeNET 5個數據庫中進行檢索,獲得皮炎相關靶點1 675個,濕疹相關靶點2 884個,銀屑病相關靶點3 697個,將皮炎、濕疹、銀屑病的靶點分別導入Venny平臺,繪制韋恩圖,獲得皮炎、濕疹、銀屑病的交集作用靶點588個,見圖1。

圖1 皮炎、濕疹、銀屑病的相同靶點韋恩圖

2.3 白鮮皮-皮炎、濕疹、銀屑病共同靶點的交集靶點

在Venny平臺上分別錄入白鮮皮15個活性成分的447個靶點與588個皮炎、濕疹、銀屑病的交集靶點,最終獲得白鮮皮活性成分共同作用于皮炎、濕疹、銀屑病的潛在靶點64個,見圖2。

圖2 白鮮皮與皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點的交集靶點韋恩圖

2.4 “有效成分-交集靶點”的網絡構建及其可視化分析

將白鮮皮的15個有效成分以及白鮮皮與皮炎、濕疹、銀屑病相同靶點的64個交集靶點輸入Cytoscape3.8.2軟件中,構建“有效成分-交集靶點”相互作用的網絡圖(圖3), 圖中黃色節點代表白鮮皮中的15種活性成分,藍色節點代表64個交集靶點,節點度值表示該成分與作用靶點的關聯個數,節點度值越大說明該成分發揮治療作用的可能性越大,其顯示在網絡中的圖標也越大。使用該軟件的Network Analyzer功能對網絡進行分析預測,按照篩選度值從大到小排序,得到白鮮皮作用于皮炎、濕疹、銀屑病的相同靶點的前5個活性成分: 赤霉素B、甘遂烷、前茵芋堿、7α-乙酰葉枯醇、白鮮明堿。

圖3 “有效成分-交集靶點”網絡

2.5 PPI網絡分析

將獲得的64個潛在作用靶點導入STRING數據庫并構建PPI網絡(圖4), PPI網絡顯示有64個節點, 465條相互作用連線,平均節點度值為14.5, 平均集聚系數為0.689。PPI網絡圖中,節點代表靶點,節點越大、顏色越深說明該靶點在PPI網絡中涉及的生物功能越多。利用Cytoscape 3.8.2軟件的CytoNCA插件對PPI網絡進行拓撲分析,以Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC這6個值為篩選條件,得到白鮮皮活性成分治療皮炎、濕疹、銀屑病的前10個潛在作用靶點,依次為腫瘤壞死因子(TNF)、Toll樣受體4 (TLR4)、血管內皮生長因子A (VEGFA)、信號轉導與轉錄激活子3 (STAT3)、信號轉導與轉錄激活子1 (STAT1)、表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型(PTPRC)、環氧合酶2(PTGS2)、基質金屬蛋白酶9 (MMP9)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARG), 見圖5。

圖4 PPI網絡圖 圖5 核心靶點圖

2.6 GO富集分析

借助Metascape數據庫對64個交集靶點進行GO富集分析,以P<0.05作為篩選標準,并對結果進行可視化處理(圖6), 共獲得1 191個生物學過程(BP)、29個細胞成分(CC)以及72個分子功能(MF), 分別選擇前10條分析結果繪制成柱狀圖。結果顯示,白鮮皮主要通過影響炎癥反應、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾等生物學過程來緩解皮炎、濕疹、銀屑病。對細胞成分的富集分析結果表明,白鮮皮的影響主要發生在膜筏、膜微區、神經元胞體。細胞因子受體結合、磷酸酶結合、配體激活的轉錄因子活性、核受體活性等分子功能與白鮮皮緩解皮炎、濕疹、銀屑病癥狀有關。

圖6 GO富集分析圖 圖7 KEGG富集分析圖

2.7 KEGG信號通路分析

KEGG信號通路富集分析說明了交集靶點與通路的關系,借助Metascape數據庫進行KEGG信號通路富集分析后共得到97條結果,前20條結果見圖7。結果顯示,相同靶點主要富集于酪氨酸激酶-信號傳導及轉錄活化因子(JAK-STAT)信號通路、白細胞介素17(IL-17)信號通路、高級糖基化終末產物-受體(AGE-RAGE)信號通路等。將前20條有關信號通路和靶點的結果借助R語言繪制靶點-信號通路圖,結果見圖8(藍色節點為靶點,粉色節點為信號通路)。對關系最密切的JAK-STAT信號通路上所有的靶點基因進行可視化處理,見圖9(節點為JAK-STAT信號通路上所有基因,其中紅色節點為JAK-STAT信號通路上此次富集的靶點基因)。

圖8 靶點-信號通路圖

圖9 JAK-STAT信號通路圖

2.8 分子對接及其可視化

為了進一步探討白鮮皮治療皮炎、濕疹、銀屑病的機制,借助Discovery Studio 2019 Client、AutoDock Tools、PyMOL進行分子對接和可視化。在pdb數據庫檢索并篩選出PTGS2、TNF、EGFR、MMP9、PPARG 共5個蛋白結構。經Discovery Studio 2019 Client軟件驗證只有TNF、EGFR、MMP9、PPARG 這4個靶點存在RMSD<2.5的蛋白構象。把白鮮皮的5個主要活性成分赤霉素B、甘遂烷、前茵芋堿、7α-乙酰葉枯醇、白鮮明堿分別與TNF、EGFR、MMP9、PPARG進行分子對接。化合物與蛋白之間的自由結合能小于-5 kcal/mol說明結合穩定,并且這個值越小表明越穩定[18]。分子對接結果提示,關鍵成分與核心靶點之間的結合都較為穩定,見表2。選擇與4個靶點結合最穩定的化合物,并對其與靶點之間的對接關系進行可視化處理,見圖10。結果顯示,其均與對應靶點的相應位點形成了氫鍵,氫鍵的數量及結合位點見表3。

表2 關鍵化合物與核心蛋白結合能

表3 關鍵化合物與核心靶點氫鍵結合數量與位點

3 討 論

本研究從白鮮皮中篩選出赤霉素B、槲皮素、前茵芋堿、木犀草素、白鮮明堿等15個有效成分,其中作用于皮炎、濕疹、銀屑病的關鍵成分是赤霉素B、甘遂烷、前茵芋堿、7α-乙酰葉枯醇、白鮮明堿?，F代藥理學研究[19]表明,赤霉素B有顯著的抗瘧原蟲活性,而甘遂烷、前茵芋堿、白鮮明堿、7α-乙酰葉枯醇具有明顯的抗炎作用。前茵芋堿可以抑制脂多糖(LPS)誘導的一氧化氮的產生來起到抗炎作用[6, 20]。

白鮮皮“同病異治”皮炎、濕疹、銀屑病的核心靶點是TNF、TLR4、VEGFA、STAT3、STAT1、EGFR、PTPRC、PTGS2、MMP9、PPARG。TNF在調節適應性和先天免疫系統中發揮重要作用,因此是感染性和非感染性炎癥性疾病的關鍵因素。TNF通過TNFR1抑制炎癥和組織變性,并通過TNFR2發揮免疫調節和組織再生的作用[21]。TLR4可被LPS激活,在天然免疫應答中起到重要調控作用?，F代研究[22]表明, TLR4在炎癥反應、調節免疫應答及腫瘤治療等方面都有一定作用。VEGF是一種有效的血管生成生長因子。VEGFA是VEGF家族7個成員中被研究得最多的成員,是血管生成的主要介質[23], 在銀屑病患者的皮膚中過度表達,并與疾病嚴重程度相關。表皮細胞中酪氨酸激酶受體(Flt1)或神經纖毛蛋白1(Nrp1)的條件性缺失可抑制由VEGFA過表達誘導的銀屑病的發生[24]。STAT1和STAT3都屬于STATs家族,具有信號轉導和轉錄激活的功能,參與調控細胞周期、細胞存活、免疫應答等過程。STAT1和STAT3在常見的細胞因子和生長因子的下游被激活,破壞其平衡可以引導細胞從存活到凋亡或從炎癥反應到抗炎反應[25]。EGFR是一種受體酪氨酸激酶,具有跨膜區和細胞內酪氨酸激酶結構域[26]。EGFR通過誘導血紅素加氧酶1(HO-1)的表達,促進牙周膜細胞的成骨細胞分化,抑制牙周炎的發生[27]。PTPCR也稱為CD45, 是一種跨膜糖蛋白,幾乎在所有造血細胞上(除成熟的紅細胞以外)表達。蛋白質酪氨酸激酶和磷酸酶活性之間平衡的破壞可導致免疫缺陷和自身免疫[28]。研究[29]證實, MMP9在銀屑病中性粒細胞中過度表達,在銀屑病皮損中含量豐富,尤其是鄰近血管內和血管周圍組織,表明MMP9可能在銀屑病血管重塑中發揮作用。PPARG在尿路上皮細胞中可以通過調控線粒體生物發生、細胞分化和炎癥反應在尿路感染中發揮重要作用[30]。PTGS2可以與多種炎癥細胞因子和介質響應,并且快速穩健地表達抑制作用[31]。

借助網絡藥理學結合分子對接技術,本研究發現白鮮皮的5個主要活性成分可能通過JAK-STAT、IL-17、AGE-RAGE等多個通路作用于TNF、TLR4、VEGFA等多個靶點,在常見皮膚病中起到抗炎止癢的作用。但這些方法有一定局限性,如數據庫更新慢和容量問題: TCMSP數據庫最新更新時間為2014年5月30日; STP數據庫每個成分只能檢索出100個對應靶點,由于篩選條件的限制,一些關鍵的化合物和靶點可能未被納入研究(藥物代謝動力學指標很多, OB和DL只是其中2個,按照OB≥30%和DL≥0.18的條件篩選藥物的有效成分不一定準確); 《中國藥典》評價白鮮皮品質的3個成分——白鮮堿、梣酮、黃柏酮,在用生物OB≥30%、 DL≥0.18來進行篩選時,不是白鮮皮的有效成分。此外,本研究只分析了部分且單一的化合物的作用,未考慮其協同作用。因此,需要更多的研究來闡明白鮮皮治療皮炎、濕疹、銀屑病的相同的作用機制。但本研究從多個數據庫和平臺獲取白鮮皮有效成分及皮炎、濕疹、銀屑病的靶點信息,并且利用網絡藥理學和分子對接技術從分子水平進行了相對科學的理論研究和驗證,對臨床藥物的研發具有一定的指導作用。