不同氧濃度微環境中腦膠質瘤細胞生物學行為變化觀察

馮鵬程，曹奕強，湯蕩，宋海，龍江，王永剛

昆明醫科大學第一附屬醫院神經外一科，昆明650000

腫瘤微環境具有低氧、低pH、高壓等特點，在腫瘤的自我更新、分化、轉移過程中發揮重要作用。現有研究表明，在膠質瘤細胞的生物進程中，缺氧微環境的形成具有顯著影響，酸性代謝產物堆積可導致細胞間質中各種細胞因子、炎癥細胞浸潤，增強膠質瘤干細胞的增殖能力和侵襲能力，并引起治療耐受，導致患者預后不良［1-2］。了解膠質瘤與其所處微環境的關系對于改善膠質瘤的治療前景具有重要意義。我們的前期研究顯示，在顱內移植神經膠質瘤小鼠中，高壓氧能夠促進顱內膠質瘤細胞增殖和血管生成，抑制細胞凋亡［3］。既往多數研究通過建立低氧或高氧微環境，認為膠質瘤生長、侵襲與氧微環境密切相關［4-7］，但缺少低氧與高氧微環境中膠質瘤細胞生物學行為變化的對比。2022年3月—7月，我們通過模擬細胞生長所處的氧微環境，觀察高氧、低氧、極低氧濃度中U251腦膠質瘤細胞生物學行為的變化。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人膠質瘤U251細胞購于昆明動物研究所。胎牛血清（美國Gibco）；青霉素/鏈霉素、胰酶、DMEM無糖培養基（大連美倫生物）；CCK-8試劑盒（日本同仁研究所）；結晶紫（北京索萊寶）；細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（江蘇碧云天）；Cell Staining Buffer購于（美國Biolegend）；488標記山羊抗兔IgG（武漢賽維爾）；TRIzol試劑盒（美國Ambion）。CO2培養箱（美國Thermo），酶標板自動讀數儀（美國BIO-RAD），倒置熒光顯微鏡（德國Motic），流式細胞儀（美國BD），實時定量熒光PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.2 細胞培養 取U251細胞，加入含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素的高糖DMEM培養基，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養。當細胞密度接近80%，進行1∶3胰酶消化傳代，取第3代細胞用于后續實驗。

1.3 細胞分組與干預處理 取對數生長期細胞，加入胰蛋白酶消化，以3×103/孔接種到96孔板，分為極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組，分別置于5%極低氧條件（37 ℃，5% CO2，5% O2）、10.5%低氧條件（37 ℃，5% CO2，10.5% O2）、21%常氧條件（37 ℃，5% CO2，21% O2）、42%高氧條件（37 ℃，5%CO2，42% O2）中培養觀察細胞形態變化，每組設6個復孔。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。各組分別于第0、24、48、72、96 h取出1塊孔板，棄上清液，每孔加入10 μL CCK-8，置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育2 h，于450 nm處測定OD值。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。取各組培養72 h的貼壁細胞，加入0.25% EDTA胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗，用1× Binding Buffer將細胞重懸至1×106/mL；轉移100 μL細胞懸液（105個）至離心管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min。加入300 μL 1× Binding Buffer，1 h內上機檢測。使用Flowjo軟件分析流式結果，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。取各組培養72 h的細胞，加入含10% FBS的完全培養基中。將Matrigel膠預先用培養基稀釋，取200 μL平鋪于Transwell小室底部多聚碳酸膜上，37 ℃干燥過夜。取5×104/孔細胞懸液200 μL接種于Transwell上室，500 μL無血清培養基加入Transwell小室下室。置于培養箱中培養5 h，待細胞貼壁更換培養基，上室用PBS清洗后添加無血清培養基，下室添加含10% FBS完全培養基培養24 h。取出用甲醇固定10 min，0.4%結晶紫溶液染色20 min，PBS漂洗。封片，倒置相差顯微鏡（×100）下觀察，分別選取上下左右及中間5個視野計數，取平均值。

1.7 細胞HIF-1α mRNA檢測 采用qPCR法。取各組培養72 h的細胞，用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。使用CFX96實時定量熒光PCR儀進行qPCR反應。引物序列：HIF-1α上游5′-AAACAGAGCAGGAAAAGGAG-3′，下游5′-TCAAAGCGACAGATAACACG-3′；GAPDH上游5′-CCCAT-CACCATCTTCCAGG-3′，下游5′-CATCACGCCACAGTTTCCC-3′。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；共40個循環。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.8 細胞ROS水平檢測 采用DCFH-DA熒光探針染色。用無血清培養液按照1∶1 000稀釋DCFHDA，使其終濃度為10 μmol/L。取各組培養72 h的細胞，加入稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌3次，去除未進入細胞內的DCFH-DA。收集細胞后上流式細胞儀檢測。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料采用Shaprio-Wilk法進行正態性檢驗，呈正態分布的數據以表示，多組間比較采用方差分析，重復測量資料采用重復測量方差分析，組間兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況比較 隨培養時間延長，各組細胞均有不同程度的增殖趨勢（F=18.651，P＜0.01）。與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組在24、48、72、96 h的增殖能力均降低（P均＜0.05）；低氧組在48、72、96 h的增殖能力高于極低氧組和高氧組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組不同時間點細胞增殖情況比較（）

表1 各組不同時間點細胞增殖情況比較（）

注：與常氧組比較，*P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.05。

組別極低氧組低氧組常氧組高氧組細胞OD值96 h 1.307 ± 0.087*△1.637 ± 0.092*2.666 ± 0.063 1.390 ± 0.097*△0 h 0.372 ± 0.341 0.356 ± 0.020 0.367 ± 0.015 0.364 ± 0.017 24 h 0.592 ± 0.058*0.592 ± 0.037*0.930 ± 0.053 0.612 ± 0.033*48 h 0.804 ± 0.053*△1.206 ± 0.120*1.603 ± 0.097 0.938 ± 0.046*△72 h 1.119 ± 0.110*△1.420 ± 0.043*2.031 ± 0.164 1.169 ± 0.117*△

2.2 各組細胞凋亡情況比較 與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組細胞總凋亡率均升高；與低氧組比較，極低氧組和高氧組細胞總凋亡率升高（P均＜0.01）。見表2。

表2 不同氧濃度下各組細胞的凋亡情況（%，）

表2 不同氧濃度下各組細胞的凋亡情況（%，）

注：與常氧組比較，*P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.01。

組別極低氧組低氧組常氧組高氧組總凋亡率30.87 ± 0.50*△3.49 ± 0.20**2.44 ± 0.31 22.15 ± 1.17*△晚期凋亡率14.10 ± 1.14 1.74 ± 0.05 1.00 ± 0.12 1.78 ± 0.23早期凋亡率16.77 ± 0.75 1.75 ± 0.15 1.45 ± 0.21 20.37 ± 1.26

2.3 各組細胞侵襲能力比較 極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組細胞侵襲數量分別為（180 ± 24）、（282 ± 24）、（451 ± 31）、（257 ± 30）個。與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組細胞侵襲數量均減少（P均＜0.01）；與低氧組比較，極低氧組和高氧組細胞侵襲數量減少（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞HIF-1α mRNA表達水平比較 極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組細胞HIF-1α mRNA表達水平分別為1.002 ± 0.073、0.500 ± 0.028、0.209 ±0.001、0.367 ± 0.017。與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組細胞HIF-1α mRNA表達水平均升高（P均＜0.01）；與低氧組比較，極低氧組表達水平升高、高氧組表達水平降低（P＜0.05或＜0.01）。

2.5 各組細胞ROS水平比較 極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組DCF熒光強度分別為91.17 ± 0.32、9.07 ± 0.28、6.25 ± 0.22、82.33 ± 0.73。與常氧組比較，低氧組、極低氧組、高氧組中細胞ROS水平均升高（P均＜0.01）；與低氧組比較，極低氧組和高氧組細胞ROS水平升高，且極低氧組高于高氧組（P均＜0.01）。

3 討論

腦神經膠質瘤是人類中樞神經系統最常見的惡性腫瘤之一，目前其治療以手術切除為主，輔以化療和放療等治療。由于大腦對化療分子耐藥或敏感性差，腦神經膠質瘤預后不良，中位總生存期為14.4個月［8］。通過改變腫瘤細胞氧微環境，以HIF及其下游信號通路為治療靶點，具有潛在的臨床應用前景。氧是包括腦膠質瘤在內的各種細胞生長微環境的重要因素。研究發現，高壓氧可抑制裸鼠皮下膠質瘤組織生長［9］；另有研究表明，高壓氧可促進小鼠顱內移植神經膠質瘤模型中膠質瘤細胞的生長［10］。而微環境中氧濃度對膠質瘤細胞生長的影響尚缺乏深入研究。在膠質瘤生長和轉移過程中，由于腫瘤細胞過度增殖，無法及時建立血管網，造成膠質瘤細胞生長處于缺氧且酸性物質積聚的微環境中［11］。低氧微環境下的腫瘤細胞可以通過改變代謝、增強侵襲和轉移、激活耐藥基因來提高適應性。

缺氧微環境中細胞的增殖和凋亡與缺氧程度有一定的關聯。涂蕓琥等［4］研究表明，適度低氧微環境可促進U251細胞體外生長。而嚴重低氧環境可誘導相關基因突變，細胞為了更好地適應環境，會啟動相關的級聯反應來誘導細胞凋亡［12］。本研究通過建立不同氧濃度微環境下的體外細胞培養模型，發現細胞在常氧下增殖能力最強，凋亡率最低，侵襲能力最強；而低氧（10.5%氧濃度）條件下較高氧、極低氧細胞生長狀態更好、凋亡率更低、侵襲力更強；極低氧環境較低氧環境細胞凋亡率升高。這種低氧調控機制可能與HIF-1調控膠質瘤細胞生長相關性基因的表達有關。在缺氧條件下，HIF-1α被激活并調控VEGF等轉錄因子誘導細胞增殖并刺激細胞發生侵襲，還負責維持未分化表型的腫瘤細胞［13］。

研究發現，反復暴露于高壓氧環境中可促進顱內神經膠質瘤細胞的增殖和血管生成，抑制細胞凋亡［14］。本研究結果顯示，隨著時間推移，高氧組細胞增殖能力較常氧組減弱；高氧組的總凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率均升高，細胞更易凋亡；高氧組細胞侵襲數量較常氧組減少。以上結果提示，高氧處理膠質瘤細胞可以促進細胞凋亡并抑制其增殖和侵襲。膠質瘤組織內微血管密度的增加、微血管形態的改變往往在病理評估上表示惡性侵襲程度增加。STUHR等［9］報道，高氧環境能夠抑制大鼠移植膠質瘤的生長，經高氧干預后，腫瘤中心平均血管密度明顯降低，腫瘤血管直徑顯著減少，隨之腫瘤的侵襲性也降低。LEE等［15］發現，膠質瘤細胞給予高氧處理后，細胞外調節蛋白激酶磷酸化水平下降，c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平上升，提示高氧可能通過JNK/ERK信號通路促進腫瘤細胞凋亡。有研究表明，高氧聯合化療可有效抑制膠質瘤干細胞增殖并促進凋亡，從而誘導其對化療再敏感［16］，通過抑制膠質瘤干細胞中ATP結合盒轉運蛋白G2、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶等化療抗性相關蛋白的表達，提高膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。YAHARA等［17］報道，對膠質母細胞瘤患者給予增強放療+高氧治療后，其2年平均生存率高于采取常規療法的患者，提示高氧能夠提高放療對腫瘤的殺傷作用，從而改善患者預后。

HIF-1是一種異二聚體蛋白，由β亞基和氧調節的α亞基組成。在常氧條件下，特定的脯氨酸羥化酶結構域蛋白以氧和α-酮戊二酸為底物，合成HIF-1α亞基。而在低氧環境下，缺氧通過激活PI3K/AKT通路，抑制HIF-1α翻譯后羥基化反應或增加ROS的線粒體產生，從而提高HIF-1α的穩定性，促進其與HIF-1β的二聚化。這種二聚化決定了復合物的激活和與缺氧反應元件序列5-（A/G）CGTG-3的連續結合，從而增加轉錄，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡和耐藥性等過程［18-19］。本研究結果顯示，低氧組細胞ROS水平較極低氧組和高氧組明顯降低；與低氧組比較，呈現極低氧組表達水平升高、高氧組表達水平降低兩種變化趨勢。這是由于高氧暴露往往改善微環境缺氧，通常增加HIF-1α蛋白降解，導致HIF-1α蛋白水平下降所導致。低氧腫瘤微環境可能與適度的ROS生成有關，而高水平的ROS可以干擾HIF-1α調節過程。YOKOE等［20］研究表明，在缺氧時，HIF-1α可以逃避pVHL的識別，從而穩定存在于缺氧環境中，并通過PI3K信號通路和缺氧激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路調節VEGF蛋白合成。也有研究認為，HIF-1α磷酸化后也可誘導VEGF靶基因轉錄。VEGF過表達與其受體結合后激活信號轉導，導致內皮細胞增殖、遷移和新生血管形成。新生血管可以為膠質瘤提供營養、氧氣，排出代謝廢物，并刺激膠質瘤生長，加速膠質瘤轉移［21］。

綜上所述，膠質瘤細胞適合生存在正常氧濃度微環境中，極低氧和高氧微環境均不適合膠質瘤細胞生長；微環境氧濃度的改變可以引發ROS/HIF-1信號通路明顯變化，從而影響膠質瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲能力。未來我們將進一步通過動物實驗研究這些信號通路變化及其相互影響，為基于HIF的分子靶向治療策略的研發提供依據。