鼻咽癌組織VEGF、LMP1表達變化與患者臨床病理特征及預后的關系

盧大松，王武峰，趙娜，馮勇軍，牟忠林

1 海南醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，海口570311；2 海南醫學院第二附屬醫院放療科；3 海南醫學院研究生院

鼻咽癌惡性程度較高，發病率及病死率均處于較高水平。鼻咽癌早期階段給予積極有效的臨床干預可顯著提高患者的5年生存率，然而大部分患者確診時已至中晚期，臨床預后差，嚴重影響患者的生命健康。鼻咽癌的病因及發病機制目前尚不明確，可能與EB病毒感染、環境、遺傳等因素密切相關［1］。探討鼻咽癌發生機制并尋求與鼻咽癌預后相關的分子標志物具有重要意義。血管內皮生長因子（VEGF）是一種內皮細胞調控因子，其表達異常升高與惡性腫瘤病程、轉移及腫瘤分期密切相關，在腫瘤形成及進展中發揮重要作用［2-3］。EB病毒潛伏膜蛋白1（LMP1）在鼻咽癌轉移過程中具有重要作用，是誘導鼻咽癌形成及轉移的主要基因之一，可作為預測鼻咽癌轉移的重要標志［4-5］。本研究通過觀察鼻咽癌組織中VEGF、LMP1的表達變化，探討二者與鼻咽癌患者臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月—2016年8月我院收治的初診鼻咽癌患者78例，均經組織病理學檢查確診。其中男42例、女36例，年齡≤60歲37例、＞60歲41例，腫瘤分級中/高分化15例、低分化63例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期58例，合并淋巴結轉移49例，有吸煙史30例。排除標準：臨床病理資料不完整；復發性鼻咽癌；合并嚴重感染性疾病或惡性腫瘤、自身免疫性疾病；合并心肝腎等重要器官功能障礙。本研究經我院醫學倫理委員會審批通過（批號2022230），患者或家屬同意參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 癌組織和癌旁組織VEGF、LMP1檢測 取癌組織及正常癌旁組織，置于4%甲醛溶液中浸泡固定，石蠟包埋，連續切片。加入二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，采用免疫組化法檢測VEGF、LMP1表達。將已知陽性標本作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。VEGF定位于細胞質，LMP1定位于細胞質或細胞膜，胞質或胞膜出現棕黃色顆粒判斷為陽性細胞。染色強度評分：未著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，重度著色為3分。陽性細胞百分率評分：未發現陽性細胞為0分，≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%為3分。將兩項評分相加，＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 預后隨訪 采用電話隨訪的方式，自手術之日起至隨訪結束或死亡，隨訪時間為5年。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。應用χ2檢驗分析VEGF、LMP1表達與鼻咽癌患者臨床特征的關系，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，兩組間比較采用Log-Rank檢驗；采用Cox比例風險模型對鼻咽癌患者進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織與正常癌旁組織VEGF、LMP1表達比較 鼻咽癌組織VEGF陽性57例（73.08%），LMP1陽性53例（67.95%）；癌旁組織VEGF陽性22例（28.21%），LMP1陽性11例（14.10%）。鼻咽癌組織VEGF、LMP1陽性表達率均高于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 不同臨床病理特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織VEGF、LMP1表達比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、合并淋巴結轉移患者的VEGF陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期、中/高分化、無淋巴結轉移患者（P均＜0.05）；合并淋巴結轉移患者的LMP1陽性率高于無淋巴結轉移患者（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織VEGF、LMP1陽性表達率比較（%）

2.3 VEGF、LMP1陽性與陰性表達的鼻咽癌患者預后比較 隨訪5年，患者生存59例，死亡19例。VEGF和LMP1陽性表達患者的5年生存率分別為59.14%、56.23%，VEGF和LMP1陰性表達患者分別為86.37%、87.91%，VEGF及LMP1陽性表達患者的5年生存率較VEGF及LMP1陰性表達患者降低（P均＜0.05）。

2.4 VEGF及LMP1表達與鼻咽癌患者預后的關系 Cox單因素分析顯示，腫瘤分化、TNM分期、淋巴結轉移、VEGF及LMP1表達是鼻咽癌患者預后的影響因素（P均＜0.05）；Cox多因素分析顯示，TNM分期、淋巴結轉移、VEGF及LMP1表達是鼻咽癌患者預后的獨立影響因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 鼻咽癌患者預后影響因素的Cox單因素分析結果

表3 鼻咽癌患者預后影響因素的Cox多因素分析結果

3 討論

早期鼻咽癌臨床癥狀缺乏特異性，一旦發病極易發生頸部淋巴結轉移，且經治療后仍有較高的復發風險，因此當下針對鼻咽癌的治療效果并不理想，5年生存率較低。目前關于鼻咽癌的病因及發生機制尚未完全闡明，因此深入探究鼻咽癌病因及發生機制并尋求可有效判斷鼻咽癌患者預后的指標尤為重要。

腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲與新生血管形成密不可分，而VEGF是一種與新生血管形成相關的主要調控因子［6-7］。VEGF作為促血管內皮細胞生長因子之一，其可通過作用于血管內皮細胞而參與細胞有絲分裂及增殖相關過程，可導致毛細血管通透性升高，最終促進腫瘤惡性進展［8］。雍軍等［9］研究表明，VEGF可導致淋巴管內皮通透性及腫瘤細胞黏附性發生變化，進而導致腫瘤細胞出現轉移。研究顯示，VEGF在機體多種正常組織中均呈低表達，但在實體瘤中表達明顯上調，且隨著腫瘤惡性程度增加而增加［10-11］。既往研究顯示，VEGF與病理分型有關，腫瘤分化越差，VEGF陽性表達率越高，且與淋巴結轉移密切相關［12］。本研究結果顯示，VEGF在鼻咽癌組織中的陽性表達率較癌旁組織顯著升高，且TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、合并淋巴結轉移患者的VEGF陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期、中/高分化、無淋巴結轉移患者。與既往文獻結果基本一致，提示VEGF在鼻咽癌組織中的表達上調可作為評估鼻咽癌浸潤、轉移的重要指標，在鼻咽癌形成及進展過程中發揮重要作用。我們對78例鼻咽癌患者進行為期5年隨訪，發現VEGF陽性表達患者5年生存率較VEGF陰性表達患者明顯下降，且Cox比例風險模型分析發現VEGF是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素。這可能是由于VEGF表達異常上調可誘導微淋巴管生成，而腫瘤細胞可經脈管間隙入侵至脈管系統，最終引發淋巴結轉移，對鼻咽癌患者預后造成不良影響。

EBV病毒在鼻咽癌患者出現頸部淋巴結轉移時發揮重要作用，而其最為突出的是持續不斷的表達LMP1，進而誘導腫瘤血管生成及腫瘤增殖轉移［13］。LMP1是公認的EBV致瘤蛋白，其可通過激活多種信號途徑而參與鼻咽癌形成及進展過程［14］。張逸錚等［10］研究顯示，LMP1可使促進腫瘤細胞侵襲和轉移的相關基因上調表達，影響腫瘤發生發展。李曉雪等［15］報道，LMP1可誘導鼻咽癌細胞運動，促進鼻咽癌的侵襲及轉移。周業等［16］報道，LMP1可增強鼻咽癌細胞增殖能力，其作用機制可能是通過激活腫瘤細胞內經典信號途徑Wnt通路實現的。本研究結果顯示，LMP1在鼻咽癌組織中的陽性表達率較癌旁組織顯著升高，且其表達與鼻咽癌患者淋巴結轉移有關。這可能是由于鼻咽癌作為一種EB病毒相關腫瘤，在其形成過程中EBV病毒活化，進而引發LMP1表達，而LMP1可通過激活細胞內多種途徑而誘導VEGF、基質金屬蛋白酶等腫瘤基因表達上調，進而引發腫瘤出現侵襲及轉移，最終導致腫瘤進展。生存分析及Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，VEGF及LMP1陽性表達患者5年生存率均較VEGF及LMP1陰性表達患者顯著降低，且其可獨立影響鼻咽癌患者預后，VEGF及LMP1表達越高，鼻咽癌患者預后越差，二者可作為判斷鼻咽癌預后的潛在標志物。

綜上所述，VEGF、LMP1在鼻咽癌組織中的表達明顯升高，兩者可能在鼻咽癌淋巴結轉移過程中發揮重要作用；VEGF、LMP1表達水平越高，患者的臨床預后越差，二者可能作為判斷鼻咽癌患者預后的重要指標。關于VEGF、LMP1在鼻咽癌形成及進展過程中的具體作用機制尚不明確，有待進一步研究探索。