上皮性卵巢癌患者血清miR-200a、miR-200b水平變化及意義

王麗雯，李靜芳，李曉紅，余鑫，楊偉，高艷章

昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院檢驗科，昆明650118

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重危害女性生命健康。由于其潛伏期長，早期缺乏臨床癥狀，多數(shù)確診時已至中晚期，預后極差。卵巢癌中超過80%的病理類型是上皮性卵巢癌（EOC），CA125是目前診斷EOC最常用的生物標志物，但其早期診斷的敏感性僅為40%［1］。因此，發(fā)現(xiàn)新的EOC診斷和預后生物標志物對于提高早期診斷的敏感性和特異性、優(yōu)化治療靶點、改善預后具有重要的臨床意義。miRNA參與了人類30%以上基因的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控，不僅與細胞的發(fā)育、分化、代謝、衰老、免疫等生命活動有關，而且與腫瘤也有密切聯(lián)系［2］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族在多種惡性腫瘤中異常表達［3-4］。目前關于miR-200a和miR-200b在EOC患者血清中的水平變化少見報道，本研究通過檢測miR-200a和miR-200b在EOC患者血清中的水平變化，分析其對EOC診斷和預后評估的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2019年6月—2020年6月收治的EOC患者80例（EOC組），年齡（51.6 ±12.5）歲。納入標準：首診于本院，經(jīng)病理檢查確診；手術、診斷和治療均參照《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南》［5］中的標準，術前未進行過激素治療、放射治療、化學藥物治療；臨床資料完整。排除標準：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；EOC為轉(zhuǎn)移癌和（或）復發(fā)癌；合并其他系統(tǒng)的重大疾病或存在重要臟器的嚴重功能損傷。另選擇卵巢良性病變80例（良性對照組），年齡（49.3 ± 11.4）歲，其中囊腺瘤36例、巧克力囊腫44例；體檢健康女性80例（正常對照組），年齡（50.6 ± 13.4）歲。三組年齡具有可比性。本研究由我院倫理委員會審核批準（批號：YLJS2022-017），獲得受試者或其家屬知情同意。

1.2 血清miR-200a、miR-200b水平檢測 采集受試者空腹靜脈血，分離血清，-80 ℃保存。加入TRIzol試劑提取miRNA，濃度和純度由美國Thermo核酸蛋白定量儀測定。將分離的miRNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，以cDNA為模板、U6為參照物，應用美國ABI 7500 PCR儀進行擴增反應，引物序列見表1。反應條件：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，40個循環(huán)；退火/延伸60 ℃ 30 s。最后記錄Ct值，以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對水平。

表1 miR-200a、miR-200b及內(nèi)參基因PCR擴增引物序列

1.3 EOC治療與預后觀察方法 EOC患者均接受手術+紫杉醇+順鉑治療方案。完成手術和6個及以上化療周期后，患者達到臨床緩解。門診隨訪2年，記錄復發(fā)情況。以停化療6個月以上，血清腫瘤標志物出現(xiàn)持續(xù)進行性增高，影像學檢查發(fā)現(xiàn)異常包塊或結(jié)節(jié)，臨床出現(xiàn)腹脹、腹痛或腹水中有癌細胞為復發(fā)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用偏度和峰度系數(shù)法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用F檢驗。采用受試者工作特征（ROC）曲線評估血清miR-200a和miR-200b對EOC的診斷價值，ROC曲線下面積（AUC）比較采用Delong非參數(shù)法；生存曲線采用Kaplan-Meier法進行Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-200a、miR-200b水平比較 EOC組血清miR-200a、miR-200b水平高于正常對照組和良性對照組，正常對照組高于良性對照組（P均＜0.01）。見表2。

表2 三組血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

表2 三組血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與良性對照組比較，△P＜0.01。

組別EOC組良性對照組正常對照組miR-200b 4.28 ± 1.95*△0.59 ± 0.35*1.05 ± 0.24 n 80 80 80 miR-200a 6.02 ± 3.33*△0.62 ± 0.41*1.14 ± 0.39

2.2 不同臨床病理特征EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平比較 EOCⅢ～Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水、腹水/腹腔灌洗液檢出惡細胞患者的血清miR-200a、miR-200b水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期、未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無腹水、腹水/腹腔灌洗液未檢出惡細胞患者（P＜0.05或＜0.01）。見表3。

表3 不同臨床病理特征EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

表3 不同臨床病理特征EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

臨床病理特征年齡＜50歲≥50歲FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期病理類型子宮內(nèi)膜樣癌透明細胞癌漿液性癌組織分化程度中/低分化高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無腹水有無腹水/腹腔灌洗液檢出惡細胞有無CA125＜300 U/mL≥300 U/mL n miR-200a P miR-200b P 1.6201.951 29 51 5.99 ± 3.49 5.61 ± 3.13 4.35 ± 2.03 4.31 ± 1.89 0.0000.000 16 64 4.17 ± 2.16 6.53 ± 2.86 3.61 ± 1.45 5.01 ± 1.59 1.5821.019 27 34 19 5.81 ± 3.62 5.22 ± 2.83 5.74 ± 3.05 3.98 ± 1.64 4.47 ± 1.23 4.32 ± 1.48 1.4420.853 21 59 5.86 ± 3.50 5.54 ± 3.11 4.33 ± 1.93 4.21 ± 1.90 0.0330.030 60 20 5.68 ± 3.44 3.75 ± 1.61 4.45 ± 2.13 3.22 ± 1.90 0.0210.022 52 28 5.63 ± 3.39 3.37 ± 2.91 4.49 ± 1.96 3.18 ± 1.34 0.0150.017 50 30 5.79 ± 3.37 3.35 ± 2.21 4.42 ± 1.84 3.09 ± 1.98 0.9540.895 42 38 5.89 ± 3.71 6.01 ± 3.84 4.35 ± 2.11 4.62 ± 1.99

2.3 血清miR-200a和miR-200b對EOC的診斷效能 將血清miR-200a和miR-200b水平作為檢驗變量、確診為EOC作為狀態(tài)變量（1=是，0=否），以正常女性和良性患者為對照，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示血清miR-200a和miR-200b有助于EOC的診斷（AUC分別為0.890和0.912），二者聯(lián)合診斷EOC的AUC為0.962，優(yōu)于單獨指標，其靈敏度和特異度均顯著提高。見表4。

表4 血清miR-200a、miR-200b對EOC的診斷效能

2.4 不同血清miR-200a、miR-200b水平的EOC患者的預后比較 對EOC患者隨訪6～24（16.6 ±7.1）個月，其中復發(fā)54例，死亡0例，復發(fā)率為67.5%，復發(fā)時間（12.7 ± 5.4）個月。以中位數(shù)將EOC患者分為低水平和高水平，Kaplan-Meier分析顯示，血清miR-200a高水平患者的復發(fā)時間為±6.7）個月縮短（P＜0.05）；血清miR-200b高水平患者的復發(fā)時間為（14.7 ± 6.9）個月，較低水平患者的復發(fā)時間（18.2 ± 7.0）個月縮短（P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌是女性病死率最高的惡性腫瘤，由于早期診斷困難、手術治療后復發(fā)率高、缺乏特異性理想的治療藥物，多數(shù)EOC患者因腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移而復發(fā)，最終導致死亡。積極尋找有效的生物標志物對卵巢癌的診斷和預后判斷具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控腫瘤相關基因，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲以及血管生成，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［6］。miR-200家族在EOC、肝細胞癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中異常表達［7］。有研究者對320例卵巢癌患者和2 759例健康婦女體液和血液中可能用于卵巢癌早期診斷的RNA標志物miR-21、miR-200家族、miR-205、miR-10a、miR-346進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)miR-200家族在EOC中的上調(diào)倍數(shù)最高，提示miR-200家族在EOC的發(fā)病機制中具有重要作用［8］。miR-200a和miR-200b屬于miR-200家族，位于1號染色體（1p33.36），通過5'種子序列與DCAMKL-1靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)配對，負責調(diào)節(jié)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［9-10］。EMT可使癌細胞獲得干細胞特性，是惡性腫瘤進展、復發(fā)和化療耐藥的主要原因［11］。EMT是EOC發(fā)生的關鍵，miR-200表達上調(diào)導致E-鈣黏蛋白表達增加，E-鈣黏蛋白表達增加可維持上皮表型和抑制EMT［12］。有研究表明，卵巢表面上皮細胞中E-鈣黏蛋白表達增加，可抑制EMT，使上皮細胞表面發(fā)生內(nèi)陷。在免疫缺陷小鼠中，E-鈣黏蛋白表達降低可誘導上皮細胞形成腫瘤［13］。miR-200家族在健康人群中正常表達，原發(fā)性腫瘤和遠處轉(zhuǎn)移患者表達上調(diào)，但在遷移和侵襲過程中表達下調(diào)［14］，卵巢良性病變可能具有惡性腫瘤的特征，如高浸潤性、高增殖率和高轉(zhuǎn)移性，在EMT過程中上皮細胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變后，才能夠突破基底膜到達遠處。本研究結(jié)果顯示，EOC組血清miR-200a、miR-200b水平均高于正常對照組，而良性對照組血清miR-200a、miR-200b水平低于正常對照組，提示miR-200家族表達水平升高有助于提示發(fā)生癌變的風險，這些抑癌基因的改變可能是卵巢良性病變向EOC轉(zhuǎn)化的早期步驟。

miR-200家族在卵巢癌中的表達失調(diào)是miRNA調(diào)控網(wǎng)絡中關鍵性的機制。miR-200家族主要靶向調(diào)控兩個轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白1/2（ZEB1/2）對癌細胞進行重編程，從而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。miR-200家族直接或間接結(jié)合 ZEB1/2使mRNA 降解，導致E-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環(huán)蛋白等上調(diào)，從而獲得間充質(zhì)標記物，使癌細胞運動性增加，進而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［8-14］。本研究結(jié)果顯示，EOC晚期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水或腹腔灌洗液檢出惡細胞患者的血清miR-200a、miR-200b水平分別高于晚期、未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水或腹腔灌洗液檢出惡細胞患者，表明miR-200a和miR-200b高水平與EOC腫瘤進展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。

傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物CA125等對于早期EOC的診斷存在敏感度較低、特異度不足等問題，血清miRNA比CA125更能反映機體的變化過程，并且取樣方便，創(chuàng)傷性小。本研究結(jié)果顯示，血清miR-200a和miR-200b用于EOC診斷的AUC為0.890和0.912，敏感度和特異度均良好，其聯(lián)合診斷價值更高，提示血清miR-200a和miR-200b是一種潛在的生物標志物，對EOC的診斷有一定的作用。

EOC患者癌癥復發(fā)的主要由癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、化學藥物耐藥和癌癥干細胞特性增強所引起。miR-200家族具有通過抑制EMT、抑制干細胞更新和調(diào)節(jié)細胞周期來介導的腫瘤抑制功能［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中miR-200a、miR-200b過度表達提示預后較差［15］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-200a、miR-200b高水平患者的復發(fā)時間較低水平患者縮短，表明血清miR-200a、miR-200b高水平的EOC患者術后易復發(fā)，預后較差。

綜上所述，EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平高于正常人群，其可能作為EOC診斷和預測復發(fā)的生物標志物，miR-200a、miR-200b水平升高者預后較差。未來隨著相關研究的不斷開展，miR-200a和miR-200b有望成為EOC診斷及預后評估的潛在生物標志物。