基于流式細胞術和SNP分型的獼猴桃倍性鑒定分析

吳 棟,王 瑀,周希希,杜佳寶,蔣景龍,張 羽*

(1 陜西理工大學 生物科學與工程學院,陜西省資源生物重點實驗室,陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心,陜西理工大學 秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室[培育],陜西漢中 723000;2 西北大學 生命科學學院,西安 710000)

獼猴桃屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl),全世界獼猴桃屬植物共有54種21變種,約75個分類單元。中國分布有52種,其中中國特有44種[1]。獼猴桃營養豐富,果實富含膳食纖維、維生素、蛋白質和礦物質等,具有顯著的經濟效益[2],其維生素C含量極為豐富,被譽為“Vc之王”。

研究發現,高倍性獼猴桃果實中的Vc含量更高[3]。多倍體獼猴桃具有果實更大、產量更高、抗逆性更強等優點,被廣泛用于育種和栽培[4]。秦巴地區是中國獼猴桃的最佳適生區之一,不僅野生資源豐富而且還是中國獼猴桃最有利用價值兩大野生品系——中華獼猴桃變種和美味獼猴桃變種的交匯區,這里孕育了遺傳基礎極其豐富的野生獼猴桃資源。

當前野生資源的利用多集中于馴化選育,其結果造成大多數栽培品種同質化嚴重、豐產性抗病性一般、耐貯性差等。獼猴桃倍性育種技術可以提高育種效率和品種改良水平,改善品種質量,提升經濟效益,為獼猴桃產業發展注入新動力[5]。

染色體是細胞遺傳的物質基礎,染色體數目的整倍和非整倍數變異是生物分類及育種的基礎,通常用染色體壓片技術來判斷植物的倍性。劉昱希等[6]利用染色體壓片技術對葫蘆科植物幼嫩子房壁進行染色體倍性鑒定。

但利用壓片技術只能判斷低倍性的物種[7],對于染色體數目多、形態小、多酚多糖次生代謝物質多、屬內不同物種倍性復雜的植物,通過染色體壓片技術也難以鑒定其倍性。如獼猴桃屬內不同物種倍性包括偶數和奇數倍從二倍體到十倍體都有[8-12],導致其分類結果也多種多樣[13],且由于其染色體基數多(x=29),其倍性的準確鑒定嚴重制約了相關生物學問題的發展。

流式細胞術被廣泛用在免疫熒光檢測、細胞周期檢測及細胞分選等領域,在動物和微生物中應用較多[14]。由于植物組織和細胞的特殊性,難以獲得適合流式細胞儀的完整細胞核懸浮液,流式細胞術在植物上的利用明顯少于動物和微生物,尤其是多倍化明顯的植物,容易造成細胞核懸浮液中核黏連、細胞核易破裂、雜質多等問題,甚至導致只有雜質峰出現,目標峰不易出現的現象。

1983年Galbraith等[15]率先將流式細胞術應用于植物細胞核DNA含量檢測和植物倍性鑒定,其熒光信號的強弱可以代表細胞核中的DNA含量,用估計DNA含量而間接判斷植物倍性。隨后該技術被大家所接受[16-17]。施春暉等[18]通過流式細胞儀對不同倍性獼猴桃核DNA含量進行測定,不同品種間DNA含量有一定的差別,但對于同一獼猴桃品種其倍性鑒定有爭議[19-20]。

SNP位點雜合子等位基因深度比率分布利用不同倍性物種全基因組SNP位點雜合子等位基因深度比率分布峰的數目和比率值范圍判斷被測樣本的倍性。

如二倍體的SNP位點雜合子比率為0.5,三倍體為0.33和0.67,四倍體為0.25、0.5和0.75,五倍體為0.2、0.4、0.6和0.8,六倍體為0.17、0.33、0.5、0.67和0.83,七倍體為0.14、0.29、0.43、0.57、0.71和0.86,八倍體為0.13、0.25、0.38、0.5、0.63、0.75和0.88,它們依次在比率值范圍處有1、2、3、4、5、6和7個峰。

隨著二代測序的廣泛利用,利用GBS(genotyping-by-sequencing)方法即可獲得一套數目不多的全基因組SNP[21],但多倍體植物的基因組組裝一直是科研人員研究的難點。目前為止,公共數據庫只有二倍體的獼猴桃雌株有參考基因組。陳廣鳳等[22]以獼猴桃雌株組裝的模擬基因組為參考,對不同基因型的SNP雜合子等位基因深度比率分布作圖來判斷倍性。

本研究通過對流式細胞術和全基因組SNP位點雜合子等位基因深度比率分布鑒定倍性方法的探索,分析適合獼猴桃的倍性鑒定方法,為相關生物學問題研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 流式細胞術倍性鑒定

1.1.1 植物材料

獼猴桃幼嫩葉片于2022年4月22日取自陜西果業集團有限公司漢中獼猴桃研發中心(N33°10′15″,E106°43′16″),用濕潤的濾紙包裹葉片置于冰盒中帶回,放入4 ℃冰箱保存,保存時間最好不超過3 d。

1.1.2 裂解液配制

(1)裂解緩沖液A:10 mmol/L MgSO4,50 mmol/L KCl,3.5 mmol/L HEPES(2%、5%、7%),聚乙烯吡咯烷酮30(2%、5%、7%),3%(V/V) Triton X-100,用1 mol/L NaOH調至pH 8.0,4 ℃冰箱預冷。(2)緩沖液B:10 mmol/L MgSO4,50 mmol/L KCl,3.5 mmol/L HEPES,5%(V/V)聚乙烯吡咯烷酮,3%(V/V)Triton X-100,0.04 mg/mL RNA酶,用1 mol/L NaOH調至pH 8.0,4 ℃冰箱預冷(表1)。

1.1.3 熒光染料

植物中常使用非特異性PI(碘化丙啶)染料,用PBS緩沖液溶解PI(0.4 mg/mL)。由于PI可使DNA和RNA同時發出熒光,因此,可以加入適量的RNA酶排除RNA干擾[23-25]。

1.1.4 準備制備液

取1 g左右的幼嫩葉片,置于盛有清水的培養皿中清洗表面的塵土,吸去葉片表面多余水分。

將葉片放入另一個預冷的培養皿中,加入提前預冷的裂解液A浸沒葉片。立即用干凈的鋒利刀片切碎葉片組織,將葉片切成非常小的碎片,操作中可適當傾斜培養皿,使葉片組織始終處于集中狀態,靜置5 min使細胞核游散出來。用過濾網過濾幾次裂解的細胞液,以除去細胞碎片和大碎片組織,至1 mL離心管中,1 000 r/min轉速離心5 min后去除上清,加入緩沖液B重新懸浮細胞核。

1.1.5 觀察制備液效果

用PI避光染色制備液15 min后,倒置在熒光相差顯微鏡(德國Leica,型號DFC450C)下觀察,根據觀察結果優化試驗影響因素。

1.1.6 流式細胞術鑒定

PI染色的制備液在24 h之內都可采用流式細胞儀(BD FACSVerse)進行倍性檢測,以‘紅陽’品種(2n=2x=58)為對照,將采集的數據用FIowJO軟件可視化判斷倍性。

1.2 基于SNP位點雜合子等位基因深度比率鑒定倍性

共51個獼猴桃樣本(25雌株,26雄株)用于GBS(genotyping-by-sequencing)測序,測序由北京諾禾致源生物有限公司Illumina2000測序平臺承擔(表2)。

利用GBS-SNP-CROPv4.1軟件[26-31](https://github.com/halelab/GBS-SNP-CROP)提供的腳本構建模擬基因組和51個不同基因型個體的SNPs分型,SNP位點雜合子等位基因深度比率分布用R可視化作圖。

2 結果與分析

2.1 基于流式細胞術的倍性鑒定

2.1.1 不同生長狀態的葉片試驗結果

研究表明,完整植物游離細胞核的獲取主要取決于葉片的生長狀態,圖1顯示老葉(直徑約5 cm)、中等大小葉片(直徑約3 cm)和未展開幼嫩葉片提取的細胞核,結果表明足夠幼嫩的葉片提取的完整游離細胞核數目較多。

A.直徑約5 cm葉片;B.直徑約3 cm葉片;C.未展開幼嫩葉片。

2.1.2 不同PVP濃度試驗分析

獼猴桃葉片中存在大量的酚類、糖類等次生代謝物質,生長時間越長的葉片越多,導致樣品提取液的粘性較高,加入適量濃度的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)可以減少細胞核黏連,促進核染料進入細胞核,圖2,A顯示雖然已經獲得較多數量的完整細胞核,但粘性物質太多阻止了核染料進入細胞核(圖2,B)。用2%、5%和7%濃度PVP在500目下過濾3次,結果(圖3)表明5%的PVP即可達到流式細胞儀判斷倍性時上樣的要求,PVP濃度增加到7%時效果與5%的相比并不明顯。

A.未染色(白光);B. PI染色后(熒光)。

圖3 使用不同濃度PVP準備的核制備液

2.1.3 不同濾網目數及過目次數試驗結果

流式細胞儀使用過程中,要盡量減少雜質的影響因素,探究濾網目數可以過濾掉碎片和黏連較嚴重的細胞核群。經過熒光染料染色后,在5% PVP過濾3次的同等條件下使用200目、300目和500目的濾網過濾待測液。

結果表明:200目和300目相對于500目的濾網過濾后的濾液中含有較多雜質,500目濾網過濾后含有較少的雜質,游離的完整的細胞核數目較多(圖4)。

圖4 不同目數的濾網過濾的制備液

由于是用物理方法切碎葉片獲取制備液,會產生較多的碎片,容易造成流式細胞儀的上樣管堵塞及雜質峰以主峰形式出現,不利于結果的分析。在5% PVP+500目的濾網的同等條件的情況下對比過目3次、4次和5次,結果表明:過目3次后增加過目次數效果并不明顯(圖5)。

圖5 不同過濾次數過濾的制備液

2.1.4 倍性鑒定結果

以已知倍性的二倍體‘紅陽’品種為對照(標準化可以是外部的,也可以是內部的,本研究采用內標法),調整電壓,使其相對熒光強度值的目標峰出現在約50 K處,而疑似四倍體DNA含量的峰值相對值約為100 K,疑似六倍體DNA含量的峰值相對值約為150 K(圖6)。‘翠香’品種經過60Co-γ照射峰值對應的橫坐標為150 K,與對照樣本的比值為3.00,估計為六倍體。

圖6 流式細胞術鑒定的部分獼猴桃染色體倍性直方圖

2.2 基于全基因組SNPs雜合子頻率分布的倍性鑒定

SNP的分型主要與模擬基因組的組裝質量(如其中每個核苷酸一致性取值參數選用)和過濾識別SNP的參數設置有關,本試驗中使用GBS-SNP-CROP流程組裝模擬參考基因組(Mock Reference,MR),然后用建立好的MR進行序列比對,生成變異體矩陣文件,過濾SNP。對該命令的參數進行調節(perl./soft/GBS-SNP-CROP-v.4.1/GBS-SNP-CROP-4.pl-in MasterMatrix.txt-out GenoMatrix.txt-indel-mnHoDepth0 5-mnHoDepth1 20-mnHetDepth 3-altStrength 0.8-mnAlleleRatio 0.25-mnCall 0.75-mnAvgDepth 3-mxAvgDepth200),其中-mnHoDepth參數含義是當替代等位基因深度等于0 時調用純合子所需的最小深度,對于二倍體物種該參數設置為5,四倍體物種設置為11,六倍體物種設置為17,八倍體物種設置為23;-mnHoDepth1參數含義為當替代等位基因深度等于1時調用純合子所需的最小深度,二倍體時參數為20,四倍體時參數為48,六倍體時參數為76,八倍體時參數為104,-mnHetDepth參數含義是調用雜合子時每個等位基因所需的最小深度,二倍體時參數為0.25,四倍體時參數為0.1,六倍體時參數為0.063,八倍體時參數為0.045;-altStrength參數含義是對于給定的推定雙等位基因變體,在整個群體中,該替代等位基因強度參數是作為次要等位基因的非主要等位基因讀數的最小比例,二倍體時參數為0.962,四倍體時參數為0.969,六倍體時參數為0.862,八倍體時參數為0.860。

根據不同倍性材料生成下游分析文件[29]。理論上Reads在模擬基因組上的覆蓋率越大,其組裝的基因組質量可信度越高,根據GBS-SNP-CROP提供的構建模擬基因組的方法,即全部雌株樣本、隨機挑選5個雌株樣本和Reads數最多的雌株樣本構建,生成的所有雜合子基因座的等位基因深度頻率矩陣(GSC.HetFreq.txt)可以使用R腳本進行可視化,生成等位基因深度分布圖,可以深入了解單個基因型的倍性水平。

最后利用GBS-SNP-CROP提供的R腳本PloidyVisualizer.R(R V3.6.2)進行可視化展示,研究發現調整參數只是影響了SNP位點雜合子等位基因深度比率分布峰圖的形狀,但峰值范圍沒有受到影響(圖7)。

圖7 不同倍性獼猴桃全基因組SNP位點雜合子等位基因深度比率分布

3 討 論

本研究對具有染色體數目多、形態小、細胞質濃、次生代謝產物多、倍性復雜的獼猴桃植物,在利用常規壓片技術判斷倍性難度較大的情況下,優化了一套適合流式細胞術倍性鑒定和全基因組SNP位點雜合子等位基因深度比率分布的方法。從理論上講,細胞、原生質體和細胞核都可以用估算DNA含量的方法判斷倍性,但因為植物的完整細胞或原生質體的大小可能接近或超過流式細胞儀的流動室孔的直徑[32],且質膜對大多數DNA熒光色素的滲透性低等其他因素的影響,導致利用細胞核估算DNA含量成為了較為合理的方法,其關鍵技術在于完整的足夠數量的游離細胞核的制備,研究發現足夠幼嫩的葉片才是獲得完整而數目多細胞核懸浮液的基礎,且充分切碎成糊狀樣以保證有足夠多的細胞核游離出來。其次,去除多酚多糖等粘性物質是保證細胞核不黏連和染料能充分進入細胞核DNA的前提,這樣才能客觀反映不同倍性的個體其DNA含量的變化。再次,根據植物細胞核的大小范圍選擇合適的濾網和過濾次數,減少雜質含量保證制備液中細胞核的濃度,上樣前最好用顯微鏡觀察以便優化試驗影響因素。最后,最好將二倍體對照樣本的目標峰的熒光通道值大小調整到成倍數的數值處,以利于多倍體倍數的判斷。雖然不同的植物組織需要探索不同的解離液配方,沒有某種解離液能完全適應所有植物[33],但只有了解解離液的主要目的和各種物質在其中發揮的作用,如解離液主要起破碎細胞的作用、PVP防止植物酚類物質帶來的細胞核黏連、且維持一定的滲透壓防止細胞核破裂而游離出完整的細胞核[34-35],才能針對試驗中出現的各種現象進行方法改良。

隨著高通量測序技術的發展,全基因組SNP數據的應用越來越廣泛,利用GBS技術即可達到研究目的。本研究不需要以染色體水平組裝全基因組,避免了多倍體植物基因組組裝的不易,只需利用GBS技術產生的全部Reads組裝成1個模擬參考基因組,通過對SNP分型即可計算SNP位點雜合子等位基因深度比率分布,然后根據不同倍性的植物其SNP具有不同的分布峰個數和峰值范圍來判斷倍性。在調整SNP calling過程中的參數研究發現,合適的參數范圍只是影響了不同倍性SNP位點雜合子等位基因深度比率分布峰的性狀,但比率分布對應的范圍值和峰的數目沒有變化。本研究建立的2種方法可以運用在屬內倍性復雜及葉片次生代謝產物多的其他植物的染色體倍性鑒定上。其中,流式細胞術簡單、成本低,但對樣本制備要求相對嚴格。全基因組SNP分型成本高,但同時可以研究許多生物學問題,如演化、分類、群體結構和遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等。本研究鑒定的中華獼猴桃變種多為二倍體和四倍體,其中紅心獼猴桃為二倍體,黃肉獼猴桃為四倍體。美味獼猴桃變種多為六倍體,與前人研究結果[36-38]一致,也許倍性差異與其果肉顏色變化有一定關聯。對六倍體獼猴桃植物經過60Co-γ照射前后倍性研究表明,輻射沒有引起獼猴桃染色體倍性的改變。

全基因組SNP分型進行倍性鑒定可以與流式細胞術倍性鑒定結果相互驗證,提高倍性判斷的準確性,為植物學基礎研究和育種工作提供參考。