水楊酸對干旱脅迫下西洋參不定根生化指標和藥用成分含量及相關基因表達的影響

盧 超,陳景鮮,王國霞,鄧培淵,2,李春閣,孫曉童

(1 鄭州師范學院 生命科學學院,鄭州 450000;2 鄭州市生物物種資源研究中心,鄭州 450000)

西洋參(PanaxquinquefoliusL.)為五加科人參屬多年生草本植物,中醫臨床上常用于氣虛陰虧、虛熱煩倦等癥,具有補氣養陰、清熱生津等功效[1]。西洋參中有多種具有生物活性的化學成分類型,包括多糖類、皂苷類、有機酸類、黃酮類和揮發油類等[1]。自1975年在北京等地引種成功以來,西洋參在中國多個省份已有大面積種植,中國已成為全球西洋參三大主產國之一[2]。干旱脅迫是制約大多數藥用植物產量和品質的一個重要逆境因素[3-4]。在面對干旱脅迫時,這些植物往往會通過滲透調節物質的積累、提高抗氧化酶類活性和改變次生代謝產物合成等應答機制來減輕傷害,從而增強植物自身的抗旱性[5]。如西洋參幼苗在遭受水分脅迫時,能通過提高體內脯氨酸含量,增強植株的抗氧化酶活性及抗氧化物含量共同來提高其抗脅迫能力[6]。燕麥在重度干旱脅迫下,葉片中的丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性顯著提高,葉片的總抗氧化能力增強[7]。

鄰羥基苯甲酸又稱水楊酸(SA)是高等植物體內廣泛存在的一類小分子酚類化合物,在植物生長過程中廣泛參與相關生理代謝過程[8]。作為一種內源性信號分子,許多研究表明SA在植物相應逆境信號脅迫和次生代謝產物生物合成過程中也發揮著重要作用[8-10]。在干旱脅迫下,外源SA處理桔梗幼苗葉片中的抗氧化酶活性明顯提高,MDA含量增加,說明外源SA能有效提高桔梗的抗旱能力[4]。人參在春季和秋季噴施SA可以增加人參皂苷含量和植株的凈光合速率,起到提高人參質量的目的[11]。此外,添加外源水楊酸會導致西洋參發狀根中抗氧化酶活性發生明顯變化,多個與人參皂苷合成的關鍵酶基因表達量上升,最終使得人參皂苷合成上調[12]。但SA是否在參與西洋參調節抵御干旱脅迫的同時,會參與次生代謝產物積累和功能基因的調控,目前尚不清楚。結合本實驗室前期已克隆的多個參與人參皂苷生物合成的關鍵酶基因,及可能參與次生代謝產物調控的轉錄因子,本研究用10%的PEG-6000模擬干旱脅迫,培養7 d后添加不同濃度的外源水楊酸處理,對不同處理下西洋參不定根中滲透調節物質的含量和保護酶活性進行比較,檢測有效成分黃酮和皂苷類化合物的積累以及參與人參皂苷合成途徑的關鍵酶基因和轉錄因子的基因表達量變化,為解析外源SA響應西洋參干旱脅迫調節的分子機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和試劑

西洋參不定根為本實驗室所誘導并傳代[13]。植物RNA提取試劑盒(9769)、反轉錄試劑盒(6210A)購自寶生物工程(大連)有限公司,熒光實時定量試劑盒(PC3302)購自北京艾德萊生物科技有限公司,PEG-6000和SA購于生工生物工程(上海)股份有限公司,人參皂苷Re(J10N11A130576)、人參皂苷Rb1(G01O11Y126429)單體對照品購于上海源葉生物科技有限公司,純度大于98%。乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑為國產分析純。

1.2 材料培養與處理

選取在23 ℃、110 r/min液體培養下生長良好的西洋參不定根,振蕩培養生長21 d后按每100 mL液體培養基10 g的比例添加PEG-6000(質量分數為10%)并培養7 d。添加過濾除菌的SA使其終濃度分別為0(S0),10(S10),40(S40),80(S80)μmol/L,每個濃度處理3瓶并重復3次,分別在SA處理0,2,4,6,8 d取不定根樣品進行相關指標測定。處理結束后樣品用無菌水沖洗并分為3份:一份吸干水分后進行脯氨酸、丙二醛(MDA)含量以及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性檢測;一份在55 ℃條件下烘干至恒重進行黃酮和皂苷含量的測定;剩余一份用于qRT-PCR檢測。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 生理指標

取0.5 g不定根樣品置于預冷研缽,加入pH 7.0磷酸鹽緩沖液勻漿并用緩沖液定容到5 mL,離心取上清為待測粗酶液。CAT活性以1 min內A240值下降0.1記為1個酶活性單位(U)。POD活性用愈創木酚法進行測定,以1 min內A470值改變0.01為1個酶活單位(U)。MDA含量采用硫代巴比妥酸法進行測定。脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取,用酸性茚三酮法進行測定。每個樣本重復測定3次。

1.3.2 藥用成分含量

將烘干的不定根粉碎經60目篩網過濾,脫脂脫色后,使用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉法進行總黃酮含量測定[14]。樣品中總黃酮以蘆丁當量(rutin equivalent,RE)表示,單位為mg RE/g DW。取0.5 g左右脫脂脫色后的不定根粉末,按1∶20的比例加入水飽和正丁醇超聲提取1 h,蒸干濾液后用甲醇回溶,定容至2 mL進行皂苷含量測定。采用單體皂苷Re為標準品,使用香草醛-高氯酸-濃硫酸法進行樣品中總皂苷的測定。采用高效液相法分析樣品中單體皂苷Re、Rb1含量,色譜柱使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相使用0.005%甲酸水和0.005%甲酸乙腈,洗脫程序參加前期摸索方法[13],檢測波長為203 nm,柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL/min,每個樣品重復測定3次。

1.3.3 qRT-PCR檢測基因表達量

提取不定根總RNA并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性,用微量核酸定量分析儀檢測濃度。合成cDNA,對內參GAPDH、6個西洋參中人參皂苷合成途徑關鍵酶基因(Pq-3-O-UGT2、Pq-3-O-UGT1、Pq-D12H、Pq-HMGR、Pq-DS、Pq-CYP6H)和2個西洋參bHLH轉錄因子(Pq-bHLH24和Pq-bHLH25)進行qRT-PCR擴增。采用20 μL擴增體系,具體引物序列見表1。反應程序采用3步法,進行40個循環,PCR擴增結束后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCT法計算轉錄因子的相對表達量,每個樣本重復測定3次。

表1 試驗用到的引物

1.4 數據處理

使用Excel 2019進行數據整理,利用SPSS 22.0對數據進行統計與顯著性分析,后期使用Photoshop CC進行圖片排版處理。

2 結果與分析

2.1 外源SA對PFG-6000脅迫下西洋參不定根抗氧化酶活性的影響

首先,在PFG-6000模擬的干旱脅迫下,隨著處理時間的延長,西洋參不定根中的CAT活性在S0處理下呈緩慢上升趨勢,在第8天時約為0 d時的1.37倍,而在不同濃度的SA處理(S10、S40、S80)后總體均呈現先上升后下降的趨勢,并均在SA處理第4天時達到最大值(圖1,A)。其中,在SA處理第4天時,西洋參不定根中CAT活性隨著SA處理濃度的升高而增加(S80>S40>S10>S0),S80分別是S40、S10、S0的1.12,1.74,2.79倍。以上結果說明西洋參不定根中的CAT活性在各濃度外源SA處理第4天時均能得到明顯提高,并以80 μmol/L SA處理效果最佳。

S0、S10、S40、S80 分別表示0,10,40,80 μmol/L的SA處理。同期不同小寫字母表示處理之間在0.05水平存在顯著性差異。下同。

其次,在PFG-6000模擬的干旱脅迫下,隨著處理時間的延長,西洋參不定根POD活性在S0、S10處理下均逐漸上升,而在S80和S40處理下均呈現先上升后下降的趨勢,并均在處理第4天時達到最大值(圖1,B)。其中,不定根POD活性在SA處理6 d內始終表現為S80>S40>S0>S10,在處理第8天時則表現為S80>S0>S40>S10處理,即S80處理始終最高,S10處理始終最低;在處理 4 d時,S80處理分別是S40、S0、S10處理的1.52倍、2.03倍和3.64倍。這說明較高濃度的外源SA有利于增強干旱脅迫下西洋參不定根中的POD活性,但較低水平的外源SA反而有抑制作用。

2.2 外源SA對PFG-6000脅迫下西洋參不定根中MDA和游離脯氨酸含量的影響

由圖2,A可知,隨著干旱脅迫時間的增長,西洋參不定根中的游離脯氨酸含量在S0處理中呈現緩慢上升趨勢,而在S80和S40處理中始終高于同期S10和S0處理,S10處理除第8天外也均高于同期S0;S80處理游離脯氨酸含量在第6天時達到峰值(29.08 μg/g),分別是S40、S10和S0處理的1.16倍、1.49倍和2.45倍。而在處理第8天時,3個外源SA處理的游離脯氨酸含量都低于相應的第6天檢測值,結果說明在0～8 d內添加10～80 μmol/L的外源SA都可以增加西洋參不定根中的游離脯氨酸含量。

圖2 外源SA處理對PFG-6000脅迫下西洋參不定根中MDA和游離脯氨酸的影響

同時,圖2,B顯示,當不同濃度的外源SA處理后,西洋參不定根中的MDA含量均隨著處理時間延長呈現先下降后上升的趨勢,且同期處理之間大多比較接近。其中,在SA處理第4天時,不定根中的MDA含量在S40處理中達到最低點(0.65 μg/g),且與其余處理均存在顯著差異;在SA處理第4天以后,各處理組MDA含量均呈現上升趨勢,而S80與S10和S0處理之間始終無顯著差異。這一檢測結果表明外源40 μmol/L SA能有效降低干旱脅迫下西洋參不定根中膜脂過氧化物的積累,減少細胞氧化損傷。

2.3 外源SA對PFG-6000脅迫下西洋參不定根中黃酮和皂苷類物質的影響

首先,黃酮類化合物是植物中分布較廣的一類重要次生代謝產物。在不同濃度的外源SA處理后,西洋參不定根中的黃酮含量總體都呈現上升趨勢,并在處理4～8 d多與S0差異顯著(圖3,A)。其中,在處理到第6天時,西洋參不定根中黃酮含量表現為S80>S40>S10>S0,各SA處理均與S0差異顯著,S80處理不定根中黃酮含量達到峰值(1.22 mg/g),分別是同期S40、S10、S0處理的1.03倍、1.22倍和1.32倍,而S80與S40之間無顯著差異。這說明外源40,80 μmol/L SA處理第6天時能有效提高西洋參不定根中黃酮類物質的含量。

其次,人參皂苷是西洋參等人參屬植物重要的藥理活性物質。由圖3,B可知,經過40 μmol/L的外源SA處理后,S40、S10、S0處理西洋參不定根中的總皂苷含量均隨著處理時間延長呈現逐漸上升趨勢,在處理第8天達到最大值,而S80處理則在第6天達到最大值,第8天時有所降低;各濃度SA處理不定根中的總皂苷含量在第4～8天均顯著高于同期S0(P<0.05),并表現為S40>S80> S10>S0。其中,S40處理總皂苷含量在第8天時達到最高點(33.16 mg/g),并顯著高于其余處理,是此時S0的1.25倍。以上結果說明添加外源SA可顯著提高西洋參不定根中總皂苷含量,但80 μmol/L的外源SA長時間處理時促進效應降低。

再次,單體皂苷Rb1和Re分別是西洋參中原人參二醇和原人參三醇型皂苷含量的代表。由圖3,C可知,西洋參不定根中單體皂苷Rb1含量在S40處理到第4～8天時均顯著高于同期S0和其余處理,并于第6天時達到最大值(25.42 mg/g),此時比S0(17.21 mg/g)顯著提高47.70%(P<0.05);S80處理僅在第8天時顯著高于S0,S10處理則始終與S0無顯著差異。說明適量添加外源SA能夠提高西洋參不定根中Rb1皂苷生物合成途徑的能量流走向。而在第8天時,S40處理不定根的單體皂苷Rb1含量(23.44 mg/g)反而比第6天明顯降低。這可能是由于Rb1皂苷繼續參與西洋參中其他原人參二醇型單體皂苷的生物代謝,因此并不能持續積累Rb1單體皂苷。不定根中單體皂苷Re含量在S40處理到第6～8天顯著高于同期S0和其他處理,在第8天時達到最大值(10.62 mg/g);S80處理在第4～6天時顯著高于S0(P<0.05),而S10處理始終與S0無顯著差異(圖3,D)。

2.4 外源SA對PFG-6000脅迫下西洋參不定根中皂苷代謝相關基因表達的影響

利用軟件設計內參基因GAPDH,6個西洋參中人參皂苷合成途徑關鍵酶基因(Pq-3-O-UGT2、Pq-3-O-UGT1、Pq-D12H、Pq-HMGR、Pq-DS、Pq-CYP6H)和2個西洋參bHLH轉錄因子(Pq-bHLH24和Pq-bHLH25)的開放閱讀框進行qRT-PCR擴增。結果表明,擴增片段在100～300 bp之間,且引物擴增特異性良好;抽取S80處理單次擴增結果進行核酸電泳檢測,電泳結果也顯示各引物的擴增效率良好,條帶單一清晰(圖4)。

M. DL2000 分子量標準;1. Pq-bHLH24;2. Pq-bHLH25;3. Pq-3-O-UGT2;4. Pq-3-O-UGT1;5. Pq-D12H;6. Pq-HMGR;7. Pq-DS;8. Pq-CYP6H;9. GAPDH。

表2顯示,3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是植物體內萜類化合物生物合成過程中的重要關鍵酶,而達瑪烯二醇合成酶(DS)是控制人參皂苷環化的關鍵酶。Pq-HMGR基因相對表達量在S10處理第2,4天以及S40和S80處理第2天都比S0組顯著升高,并在S40處理第2天達到最大值,是S0組的3.11倍,且與其余處理組和處理時間存在顯著差異(P<0.05)。Pq-DS基因相對表達量在S10處理第2天和及S40處理第2、4天都比S0組顯著升高,并在S40處理第2天達到最大值,是對照組的3.74倍,且與其余處理組和處理時間存在顯著差異(P<0.05)。HMGR和DS基因表達量的顯著升高,說明代謝流的明顯增加,進而促進了人參皂苷的生物合成。同時,Pq-CYP6H和Pq-D12H是CYP450基因家族控制羥基化反應的關鍵酶基因。Pq-CYP6H基因相對表達量在S10和S80處理第2天以及S40處理第2天都比S0組顯著升高,并在S40處理第2天達到最大值,是S0組的1.55倍;Pq-D12H基因表達量僅在S40處理第2天都比S0組顯著升高,是對照組的1.78倍,都與其處理組合處理時間存在顯著差異(P<0.05)。另外,糖基轉移酶Pq-3-O-UGT1基因的轉錄水平在S10、S40和S80處理第2天都比S0組顯著升高,并在S80處理到第2天時達到最大值,是S0組的1.64倍,說明Pq-3-O-UGT1基因收到SA信號時存在應答影響;而Pq-3-O-UGT2基因在受到SA刺激時,并未表現出明顯的轉錄水平升高。

表2 外源SA處理對6個關鍵酶基因和2個轉錄因子基因表達量的影響

此外,外源添加SA后,轉錄因子Pq-bHLH25存在應答響應,在S10和S40處理誘導到第2天時達到最大值,是S0組的1.71倍,顯著高于其余處理組合處理時間;而Pq-bHLH24基因的轉錄水平雖然在S40處理誘導到第2天時有最大值,但變化并不顯著(P>0.05)。西洋參不定根中皂苷代謝相關基因表達量在不添加SA條件下(S0)始終無顯著變化。可見,西洋參不定根中皂苷代謝相關基因Pq-HMGR、Pq-DS、Pq-CYP6H、Pq-D12H、Pq-3-O-UGT1Pq-bHLH25相對表達量大多在外源40 μmol/L SA處理第2天時達到最大值,顯著高于其余處理組合處理時間,Pq-3-O-UGT2、Pq-bHLH24表達量則無顯著變化。

3 討 論

許多研究表明,水分、溫度、光照和激素等非生物信號在人參屬植物的生長發育和藥用成分的生物合成過程中發揮著重要作用[15-16]。在本研究不加SA的對照組實驗數據中顯示,低濃度的PEG模擬干旱會導致西洋參不定根中的抗氧化酶POD和CAT活性緩慢上升。這是由于植物體內的抗氧化酶類活性在植物受到脅迫情況下受到誘導增強,通過清除自由基等方式來保護膜系統,從而緩解脅迫作用。這與高巖等用PEG模擬干旱脅迫處理人參愈傷組織時,愈傷組織鮮重隨干旱脅迫的加劇而明顯抑制結論相一致,說明干旱脅迫會對西洋參正常生長產生不利影響[17]。SA是植物體內廣泛存在并在多種植物中參與逆境脅迫調節和次生代謝產物的生物合成過程[18]。在桔梗幼苗遭遇干旱脅迫時,外源SA可以顯著提高幼苗葉片和根中的抗氧化酶活性,以減輕干旱對桔梗幼苗的危害[4]。本研究也發現經過80 μmol/L的SA處理西洋參不定根第4天時,其CAT和POD活性分別是未經SA處理對照的2.79倍和2.03倍。除了抗氧化酶活性有明顯變化,西洋參不定根中的滲透調節物質也對SA信號產生響應。本試驗在添加不同濃度SA后,不定根中MDA的含量出現了先下降后上升的趨勢,而脯氨酸的含量呈現了先上升后下降的趨勢;在40 μmol/L SA處理到第4天時,MDA的含量達到檢測值的最低點,說明40 μmol/L的SA可以減少細胞的損傷。這與其他研究中低濃度外源SA可緩解干旱脅迫造成的傷害的結論[5]相一致。

任春林等發現SA能提高白樺懸浮細胞中齊墩果酸的含量[19],梁瑩在西洋參發狀根培養過程中添加0.001 mg/L SA,培養5 d時人參皂苷含量是對照組的1.2倍[12]。在本試驗中,西洋參不定根中的總黃酮、總皂苷、單體皂苷Rb1和Re含量在SA處理后都出現了最大值,說明SA在調節不定根內抗氧化酶和滲透調節物質的同時,也會參與調節體內次生代謝產物的積累。王晨等研究發現非生物信號刺激下,北柴胡根內JA等信號物質含量增加,促進調節基因BcMYC2的表達,進而提高柴胡皂苷生物合成途徑中關鍵酶基因的表達,最終顯著增加柴胡皂苷的含量[20]。本研究中qRT-PCR實驗結果也顯示HMGR和DS等關鍵酶基因的表達量在外源40 μmol/L SA處理第2天均顯著上升,這與梁瑩等的研究結果[12]相一致。由此推測,次級代謝產物的積累量增加可能是由于SA調控這些化合物生物合成中的關鍵酶基因表達量、轉錄因子及啟動子活性等方式,繼而影響到西洋參不定根體內代謝流的走向。在筆者其他在研項目中還發現這些編碼基因上游存在著SA響應元件,暗示它們之間可能存在相互影響和促進,在植物激素誘導時進行協同交互響應,但具體的調控通路和機制仍需進一步研究。

綜上所述,在干旱脅迫條件下,外源SA處理可有效提高西洋參不定根中抗氧化酶CAT和POD的活性,有利于游離脯氨酸的積累和MDA含量的降低,緩解干旱脅迫對西洋參不定根的傷害。40 μmol/L的外源SA處理有利于西洋參不定根中有效成分總黃酮、總皂苷和單體皂苷Rb1和Re含量的積累,并促使參與人參皂苷合成途徑的HMGR等關鍵酶基因的表達量顯著升高。因此,適宜濃度的外源SA可以改善西洋參不定根在干旱脅迫環境下的生長狀態,緩解干旱脅迫,促進藥用有效成分積累。