miR-204在兒童神經母細胞瘤中的表達及其對癌細胞生長的影響

宋麗麗,王亞峰,管玉潔,黃閃,劉煒

(鄭州大學附屬兒童醫院 血液腫瘤科,河南 鄭州 450000)

神經母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童最常見的惡性實體腫瘤之一,具有異質性高、惡性程度高、生長迅速等特點[1]。目前治療NB的方法有手術、化療、放療及自體干細胞移植等,但臨床效果及預后欠佳,因此探索NB的分子機制對早期診斷、預后改善有重要意義[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼小分子RNA,不僅參與細胞增殖、凋亡和侵襲等過程,還與多種惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關[3-4]。miR-204是一類重要的miRNA,在多種惡性腫瘤中異常表達,在癌細胞增殖、遷移及侵襲中發揮重要調控作用[5-6]。但目前國內外缺乏關于miR-204與NB的研究,且其作用機制有待進一步明確。本研究通過檢測NB患兒腫瘤組織中miR-204的表達,探討其與NB臨床病理及預后的關系,同時分析過表達miR-204對NB細胞增殖、遷移和侵襲的影響,初步探討其在NB中的生物學功能及機制。

1 對象與方法

1.1 病例資料

收集2020年1月至2022年1月在鄭州大學附屬兒童醫院治療的NB患兒的腫瘤組織及癌旁組織標本。入選標準:經臨床、影像學及病理學確診為NB,初次治療且臨床資料完整。本研究共納入42例NB患兒,其中男22例,女20例;年齡3～120個月;臨床分期Ⅰ期4例,Ⅱ期6例,Ⅲ期9例,Ⅳ期18例,Ⅳs期5例;發生骨轉移11例;危險度中低危22例,高危20例;N-myc擴增有7例,無35例。出院后所有患兒定期復查,隨訪時間截至2023年1月?？偵嫫?overall survival,OS)指從初始住院至死亡。

1.2 實驗材料

人NB細胞SH-SY5Y購自中國科學院細胞庫,Trizol提取試劑和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;miR-204 mimics及mimics-NC購自上海吉瑪制藥技術有限公司,miR-204和U6引物由上海生工生物公司合成,CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,Transwell小室購自美國Corning公司,Bax、Bcl-2、VEGF、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自英國Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養和分組

SH-SY5Y細胞置于含10%(體積分數)胎牛血清和1%(體積分數)青霉素/鏈霉素的DMEM培養液中,并置于含5%(體積分數)二氧化碳的37 ℃培養箱中培養。細胞培養液每隔2 d更換1次,待細胞生長至約85%密度時進行傳代培養。培養3～5代后,取對數生長期細胞進行后續實驗,將細胞隨機分為miR-204 mimics(轉染miR-204 mimics)組、mimics-對照(mimics- normal control,mimics-NC)組(轉染miR-204 mimics的陰性對照)、空白對照(blank control,BC)組(不進行轉染),根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明進行操作。轉染24 h后開始進行后續實驗。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測miR-204表達

按照zTriol提取試劑盒操作說明提取組織及細胞總RNA,然后按照反轉錄試劑盒操作說明將總RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行qPCR擴增。miR-204引物序列:上游為5’-CCTTTGTCATCCTATGCC-3’,下游為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’。U6引物序列:上游為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。qPCR反應條件:95 ℃預變性1 min,95 ℃變性30 s,55 ℃變性30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環。以U6為內參,用2-△△Ct法計算miR-204的相對表達量。

1.3.3CCK-8法檢測細胞增殖活性

將各組細胞分別接種于96孔板(每孔5×103個細胞)中繼續培養。分別培養24、48、72和96 h后加入10 μL CCK-8溶液,孵育4 h,用酶標儀測定450 nm波長處各組吸光度值。每組設6個復孔,實驗重復3次。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡

取各組細胞(1×105個細胞)離心重懸于結合緩沖液中,加入1×Binding Buffer懸浮細胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育15 min后加入5 μL PI染色。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.5Transwell法檢測細胞遷移和侵襲力

細胞遷移實驗:取各組細胞,用無血清培養液重懸(每毫升5×105個細胞),取200 μL加入上室,將600 μL含10%(體積分數)胎牛血清的培養液加入下室。培養24 h后取出小室,用棉簽去除散落細胞,40 g·L-1多聚甲醛固定,1 g·L-1結晶紫染色,風干,鏡下觀察,隨機抽取5個視野計數穿膜細胞數,實驗重復3次。細胞侵襲實驗:將基質膠按1∶8稀釋,包被Transwell小室基底膜。其余步驟同細胞遷移實驗。

1.3.6Western blot法檢測相關蛋白表達

收集各組細胞,采用蛋白提取試劑盒提取蛋白,并采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜后用50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h,洗膜后加入Bax、Bcl-2、VEGF、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗(稀釋比1∶1 000),4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,加入ECL化學發光,成像、拍照。利用Image J軟件進行圖像分析,以GAPDH為內參分析各蛋白條帶灰度值,并計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 miR-204在NB患兒腫瘤組織中表達

NB患兒腫瘤組織中miR-204表達水平(0.45±0.11)低于癌旁組織(1.02±0.58),差異有統計學意義(t=6.587,P<0.001)。

2.2 miR-204低表達組與高表達組相關指標

將42例NB患兒按照miR-204表達的中位值(0.45)分為高表達組(≥0.45)和低表達組(<0.45)。miR-204高表達組和低表達組臨床分期、骨轉移、危險度及N-myc比較差異有統計學意義(P<0.05),兩組間性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。NB患兒的中位隨訪時間為25(8～36)個月。采用Kaplan-Maier方法分析miR-204表達與預后的關系,結果發現miR-204低表達組OS短于高表達組(χ2=5.122,P=0.024),見圖1。

圖1 NB患兒miR-204水平與OS的相關性

表1 miR-204低表達組與高表達組相關指標比較[n(%)]

2.3 各組細胞miR-204表達水平

miR-204 mimics組細胞中miR-204表達水平高于BC組和mimics-NC組(P<0.05);BC組和mimics-NC組miR-204表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

2.4 上調miR-204后對細胞增殖活力的影響

miR-204 mimics組24、48、72和96 h時細胞吸光度值均低于BC組和mimics-NC組(P<0.05)。BC組和mimics-NC組各時間點細胞吸光度值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

2.5 上調miR-204后對細胞凋亡的影響

Annexin V/PI雙染結果顯示,miR-204 mimics組的細胞凋亡率高于BC組和mimics-NC組(P<0.05),而BC組和mimics-NC組間細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖4A。進一步對凋亡下游標志蛋白進行檢測,結果顯示,與BC組和mimics-NC組相比,miR-204 mimics組Bax蛋白表達水平升高,Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05);BC組和mimics-NC組細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖4B。

A為上調miR-204對NB細胞凋亡的影響;B為上調miR-204對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響;與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

2.6 上調miR-204后對細胞遷移和侵襲力的影響

miR-204 mimics組細胞遷移和侵襲能力均低于BC組和mimics-NC組(P<0.05);BC組和mimics-NC組細胞遷移和侵襲能力比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖5。Western blot分析遷移和侵襲相關標志性蛋白表達顯示,miR-204 mimics組VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均低于BC組和mimics-NC(P<0.05);BC組和mimics-NC組細胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖6。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

3 討論

NB是兒童常見的惡性腫瘤,約占兒童癌癥病死率的15%[7]。雖然近年來NB的診療手段得到很大改進,但該腫瘤極易復發,預后差,嚴重威脅兒童生命健康[8-9]。因此尋找新的分子靶點對NB的診斷、治療及預后評估有重要意義。隨著基因芯片、原位雜交及高通量測序等技術的快速發展和應用,miRNA在多種腫瘤發生發展及預后中的作用已成為研究熱點。因此,鑒定NB相關miRNA不僅有利于理解miRNA在腫瘤發生中的作用,而且對探尋新的治療靶點也非常重要。miR-204是一類重要的miRNA,在多種惡性腫瘤中異常表達,與腫瘤的發生發展、預后及耐藥性密切相關[10-11]。Zhang等[12]研究發現,miR-204在膽囊癌患者血清及癌組織中低表達,可作為膽囊癌的診斷指標,且與TNM分期、遠處轉移、分化程度及不良預后有關。Li等[13]研究發現,膀胱癌組織和細胞系中miR-204的表達降低,與T分期與淋巴結轉移相關。丁祺等[14]研究發現,卵巢癌患者血清miR-204水平降低,與臨床分期、淋巴結轉移和生存時間縮短有關。本研究結果顯示,miR-204在NB患兒腫瘤組織中異常低表達,與骨轉移、臨床分期、危險度及N-myc擴增密切相關,同時生存分析發現miR-204低表達NB患兒OS短于高表達組,提示miR-204的低表達與NB不良預后有關,與以往的研究結果[15]類似,進一步證明miR-204與NB患兒預后有關。

此外,大量證據顯示miR-204不僅與多種惡性腫瘤預后有關,還能影響癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等[16-17]。Li等[18]研究發現,miR-204在所有檢測的肺癌細胞系中均下調,且通過靶向增殖細胞核抗原-1調節肺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。Fan等[19]研究發現,miR-204在所有檢測的乳腺癌細胞系中均表達下調,通過靶向PI3K/AKT通路抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲轉移,促進細胞死亡和G2/M細胞周期阻滯。范曉紅等[20]研究發現,miR-204靶向Bcl-2影響卵巢癌細胞增殖和凋亡。本研究結果顯示,上調miR-204后,SH-SY5Y細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低,凋亡率升高。此外,Western blot檢測結果顯示,過表達miR-204后凋亡相關蛋白Bax表達水平升高,Bcl-2蛋白表達水平降低,同時遷移和侵襲相關蛋白(VEGF、MMP-2和MMP-9)降低,說明上調miR-204表達能夠抑制NB細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。

4 結論

miR-204低表達與NB患兒臨床分期、骨轉移、危險度、N-myc擴增及不良預后密切相關,并對NB細胞的增殖、侵襲和遷移和凋亡具有調控作用,可作為NB患兒的潛在預后評估和治療靶標,為臨床診治提供新的方向。