近紅外光譜結合化學計量學快速測定羊棲菜抗氧化活性

曹小青，曾 麗，黃 靜，韋思思，佟海濱，張 旭，吳明江*，楊 越*

（1．溫州大學 生命與環境科學學院，浙江 溫州 325035；2．浙江省水環境與海洋生物資源保護重點實驗室，浙江 溫州 325035）

羊棲菜是一種隸屬于馬尾藻科的食用褐藻，是韓國、日本和中國沿海居民的傳統美食［1］。羊棲菜與紫菜、海帶和裙帶菜同屬我國四大經濟海藻［2］。與其它3種海藻的不同之處在于，羊棲菜不僅可以用作食材，還是一味具有悠久歷史的中草藥［3-4］，文獻報道其具有補血、降血壓、軟堅化痰等功效［5-7］。多糖、多酚、總黃酮和巖藻黃質等是羊棲菜的主要活性成分，均具備良好的抗氧化活性［6-7］。此外，羊棲菜還具有抗腫瘤、抗肥胖、消炎及降血脂等活性作用［8-9］。由于具備較高的營養和藥用價值，羊棲菜在食品、醫藥和護膚品等領域具有廣闊的發展前景［10］。不同的生長環境如溫度、光照、鹽度和潮汐等因素會直接影響羊棲菜抗氧化物質的積累及抗氧化活性，從而導致羊棲菜品質存在明顯差異。基于健康和經濟方面的考慮，食品品質日益受到消費者和經銷商的關注。因此，非常有必要對羊棲菜的抗氧化活性進行評價以保證羊棲菜的品質和保護消費者的利益。目前常見的抗氧化活性的測定方法有紫外-可見分光光度法［10-11］、化學發光法［12-13］和高效液相色譜法［14］。然而這些分析方法往往存在測定耗時、操作過程繁瑣、實驗技能要求較高、使用的有機試劑污染環境等缺點。因此，亟需建立一種快速、簡便、準確的羊棲菜抗氧化活性分析方法，以提升羊棲菜品質控制水平，豐富其質量評價體系。

近紅外光譜技術（Near-infrared spectroscopy，NIRS）是光譜技術結合化學計量學方法和計算機技術的一種間接高新分析技術，具有快速、簡便、綠色、多組分同時測定和可實現在線分析等優點［15-16］，現已被廣泛應用于食品、農業、醫藥、煙草、石油化工等眾多領域［17-19］。目前已有少量研究報道了NIRS 在車厘子、藜麥等食品抗氧化活性測定方面的應用［20-22］，然而其在可食用海藻相關方面的應用尚未見報道。NIRS因具有簡單快速、不污染環境、測定成本低和樣品無需預處理等優點，已被證實可以作為傳統體外抗氧化活性測定方法的替代方法，具有廣闊的應用前景。目前，尚未發現基于NIRS對羊棲菜抗氧化活性定量分析的研究報道，羊棲菜抗氧化活性定量模型的建立將為羊棲菜的品質提升和開發利用提供一定的借鑒，從而提高羊棲菜的營養價值和經濟價值，并為NIRS應用于海藻質量評價提供理論依據和應用支持，豐富和發展海藻質量評價的方法體系。

本研究采用NIRS 和偏最小二乘法（PLS）構建定量校正模型，并通過光譜預處理方法和變量選擇方法優化模型性能，建立了一種快速、簡便、準確的羊棲菜抗氧化活性分析方法，可在維護羊棲菜市場秩序、提升羊棲菜品質控制水平、推動我國羊棲菜產業的穩定持續發展方面提供幫助。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、過硫酸鉀、三吡啶三吖嗪、七水合硫酸亞鐵、無水醋酸鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；冰醋酸、濃鹽酸（分析純，浙江中星化工試劑有限公司）；六水合三氯化鐵、無水乙醇（分析純，廣東西隴科學股份有限公司）；實驗用水均為去離子水（美國Millipore）。

羊棲菜，采集于浙江省洞頭市羊棲菜養殖基地，采集時間分別為2020年12月11日、2021年1月9日、2021 年2 月1 日、2021 年3 月5 日、2021 年4 月4 日、2021 年4 月19 日。每批在同一生長海域采集外觀、長短一致的25個羊棲菜樣本。

1.2 儀器與設備

Binder 恒溫鼓風干燥機（上海合測實業公司）；Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；TU1810 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；JP-040S 超聲清洗機（深圳潔盟清洗設備有限公司）；CT15RT 型高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程公司）；OSB-2200水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；800Y高速多功能粉碎機（永康鉑歐五金制品有限公司）；SQP型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 近紅外光譜的采集

羊棲菜用流動水清洗干凈，置于恒溫鼓風干燥機中于80 ℃下干燥4．5 h 至恒重。將干燥羊棲菜粉碎，過80 目篩網，每批得到25 份粒度均勻的羊棲菜粉末，6 批共計150 份羊棲菜粉末。取每份羊棲菜粉末樣本平鋪于樣品杯中，以空氣為參比，漫反射掃描模式，光譜掃描范圍為4 000～10 000 cm-1，掃描次數為64次，分辨率為8 cm-1，每個樣本掃描3次，取平均光譜用于后續數據處理。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 羊棲菜提取液的制備

精密稱取羊棲菜粉末50 mg于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，于室溫在超聲清洗機功率240 W下超聲20 min，取出，3 000 r/min離心10 min，所得上清液即為羊棲菜提取液，于冰箱4 ℃保存。

1.4.2 測定DPPH自由基清除能力

參考Guo 等［23］的實驗方法并進行調整，將樣品溶液（2 mL）與DPPH 的乙醇溶液（0．1 mmol/L）2 mL（A1）或乙醇溶液2 mL（A2）混合，搖勻，室溫下避光反應30 min。以去離子水（2 mL）與DPPH的乙醇溶液（2 mL）混合作為對照（A0），在517 nm處測定每種混合溶液的吸光度。每個樣品一式3份，清除率計算如下：

其中A0為對照組的吸光度，A1為樣品溶液混合DPPH乙醇溶液的吸光度，A2為樣品溶液與乙醇混合溶液的吸光度。

1.4.3 測定ABTS自由基清除能力

采用Muhammad等［24］的實驗方法，并進行調整。將ABTS水溶液（7 mmol/L）100 mL和過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）1．76 mL 置棕色瓶中，混合均勻，于黑暗室溫環境中靜置12 h 得ABTS 母液。將ABTS 母液用去離子水稀釋至734 nm 處的吸光度為0．70±0．02，即得到ABTS 工作液。然后，將樣品溶液（200 μL）與ABTS 工作液4 mL（A1）或去離子水4 mL（A2）混合，室溫避光靜置30 min。以去離子水（200 μL）為對照（A0），在734 nm處測定每種混合溶液的吸光度。每個樣品一式3份，清除率由式（1）計算。式中A0為對照組的吸光度，A1為樣品溶液混合ABTS 工作液的吸光度，A2為不含ABTS 工作液的樣品溶液的吸光度。

1.4.4 鐵離子還原能力測定（FRAP法）

1.4.4.1 樣品溶液的測定參考Guan等［25］的方法進行FRAP 法測定。將醋酸緩沖液（300 mmol/L，pH 3．6）100 mL、三吡啶三吖嗪-鹽酸溶液（10 mmol/L）10 mL、三氯化鐵溶液（20 mmol/L）10 mL 混合制備FRAP工作液，37 ℃水浴備用。然后，將樣品溶液（400 μL）與FRAP工作液（3．6 mL）混合，室溫暗處靜置30 min。以去離子水（400 μL）作為空白，在593 nm 處測定吸光度，每個樣品平行制備3 份。鐵離子還原能力以硫酸亞鐵濃度（μmol/L）表示。

1.4.4.2 標準曲線的繪制精確稱取七水合硫酸亞鐵0．013 9 g 于容量瓶中，加去離子水溶解定容，即得1 000 μmol/L 的硫酸亞鐵溶液。配制0、50、100、200、300、400、500 μmol/L 的硫酸亞鐵溶液，精密移取不同濃度的硫酸亞鐵溶液0．4 mL于試管中，加入預熱到37 ℃的FRAP工作液3．6 mL，避光靜置30 min，于593 nm 波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，硫酸亞鐵濃度（X，μmol/L）為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y= 0．001 7X+ 0．000 5，r2= 0．999 5，線性關系良好。

1.4.5 紫外-可見分光光度法方法學驗證

1.4.5.1 精密度實驗按照DPPH、ABTS和FRAP 方法連續測定6次樣品吸光度，各成分的相對標準偏差（RSD）分別為0．11%、0．080%、0．35%，均小于5．0%，精密度良好［26］。

1.4.5.2 重復性實驗平行制備6份樣品，分別測定其DPPH、ABTS和FRAP 抗氧化活性，各成分的RSD值分別為1．5%、2．9%、1．1%，均小于5．0%，重復性良好。

1.4.5.3 穩定性實驗取同一樣品，在1 h 內測定其DPPH、ABTS 和FRAP 抗氧化活性，各成分的RSD值分別為2．3%、1．3%、3．5%，均小于5．0%，樣品在1 h內穩定性良好。

1.5 數據處理及模型性能評價

采用TQ Analyst 軟件進行異常光譜的識別和光譜預處理方法的選擇，建模變量選擇采用MATLAB 2014a 軟件，制表軟件為Word 2019，數據統計使用Excel 2019 軟件，繪圖軟件為Origin 2021。模型性能評價參數通常包括校正集相關系數（RC）、校正集均方根誤差（RMSEC）、預測集相關系數（RP）和預測集均方根誤差（RMSEP）。通常RC和RP越接近于1，RMSEC 和RMSEP 越小且越接近表明模型預測性能越高。

2 結果與討論

2.1 近紅外光譜分析

圖1A 為羊棲菜在4 000～10 000 cm-1的近紅外原始光譜圖。可以看出，所有樣本的近紅外光譜變化趨勢基本一致。圖1中5 155 cm-1和6 944 cm-1處有兩個明顯的吸收峰，歸屬于水分子O—H 伸縮振動的組合頻和一級倍頻。其他較強吸收主要位于4 288、4 389、5 774、8 230 cm-1附近，4 288、4 389 cm-1處的吸收譜帶歸屬于C—H 和—CH2伸縮和彎曲振動的組合頻；5 774 cm-1處的峰與C—H 伸縮振動的一級倍頻有關；8 230 cm-1處為C—H 伸縮振動的二級倍頻［27］。采用馬氏距離法識別DPPH 模型的異常光譜（圖1B），可將異常光譜排除在閾值（虛線）之外。對于DPPH、ABTS 和FRAP 3 個抗氧化指標，分別檢測出5、5和6個異常光譜。最終，DPPH、ABTS和FRAP的建模樣本數分別為145、145和144。

圖1 羊棲菜近紅外原始光譜圖（A）和DPPH模型異常光譜判別圖（B）Fig．1 Raw NIR spectra of Sargassum fusiforme（A） and discrimination of anomalous spectra for DPPH model（B）

2.2 校正集與預測集劃分

合理評價模型性能需要將樣本劃分為校正集和預測集，分別用于構建和驗證校正模型。本實驗采用濃度梯度法選取3/4的樣本作為校正集，剩余1/4樣本作為預測集。總樣本集、校正集和預測集樣本中參考值的數據統計結果見表1。可以看出，對于3種抗氧化活性指標，校正集和預測集樣本的平均值和標準偏差均十分接近，并且校正集樣本參考值的范圍涵蓋了預測集的范圍，說明校正集與預測集的劃分合理，有助于建立穩定的校正模型。

表1 樣本的數據統計結果Table 1 Statistics results of samples

2.3 光譜預處理方法的選擇

近紅外光譜重疊嚴重，光譜易受到噪聲、基線漂移、信號本底、光散射以及樣品顆粒不均勻等帶來的干擾［28-30］。因此有必要對原始光譜進行預處理，提高模型的穩健性和預測性能。

本研究采用表2 中的4 種光譜預處理方法對原始光譜數據進行優化：一階導數結合Savitzky-Golay平滑（1D+SG）、二階導數結合Savitzky-Golay 平滑（2D+SG）、多元散射校正（MSC）和標準正態變換（SNV），其中SG平滑的窗口寬度為5，多項式次數為2。使用1D+SG、2D+SG、MSC和SNV方法可以分離重疊峰、消除光譜散射效應和基線漂移。表2 中粗體表示最佳光譜預處理方法下的建模結果，可以發現，DPPH、ABTS和FRAP 模型均在選擇1D+SG 光譜預處理方法時RMSEP 最小，分別為2．65、0．89和3．54。由于近紅外光譜中包含大量冗余信息，且波長變量數過多，需要通過變量選擇算法來選擇關鍵變量。競爭性自適應重加權采樣（CARS）算法是一種多變量優化方法，特別適用于高維數據的變量選擇。與其他方法相比，CARS利用指數衰減函數（EDF）去除回歸系數絕對值較小的波長，可有效避免過擬合風險［31］。后續基于1D+SG 預處理后的光譜數據分別建立DPPH、ABTS 和FRAP 的Full-PLS 模型和CARS-PLS模型，并比較其預測效果。

表2 不同光譜預處理方法的建模結果Table 2 Modeling results of different spectral preprocessing methods

2.4 建模變量的選擇

CARS算法采用蒙特卡羅采樣方法，即從校正集隨機抽取一部分樣本建立PLS模型，反復進行上百次取樣，對變量逐個篩選，最終選取關鍵的波長變量，同時CARS 通過引入EDF 解決了變量選擇中的組合爆炸問題［31］。CARS 和PLS 相結合可以簡化建模過程，提高預測模型的精度。在本研究中，CARS算法運行100 次，每次運行均使用80%的隨機樣本建立PLS 模型。圖2A～C 分別顯示了CARS 程序運行過程中DPPH 模型采樣變量數、交叉驗證均方根誤差（RMSECV）的變化趨勢以及各變量的回歸系數路徑。從圖2A可以看出，在基于EDF的變量提取的第一階段，隨著采樣次數的增加，保留變量的數量迅速減少，第二階段則緩慢減少，屬于典型的EDF 兩步篩選。從圖2B 中可以看出，采樣運行次數在0～58范圍內，由于剔除了大量不相關變量，RMSECV 緩慢下降；在58次采樣運行后，RMSECV 基本保持穩定，直到去除一些有用信息變量后，RMSECV 才顯著增加。如圖2C 所示，當采樣次數為58 次時，RMSECV 達到最小值，在圖2C 中用藍色垂直星號線標記，第58 次采樣時保留的變量數為34。通過CARS，DPPH、ABTS和FRAP分別選擇34、66和50個變量進行建模。

圖2 DPPH光譜數據的CARS變量選擇圖Fig．2 Plots of CARS variables selection on spectra data for DPPH A，B and C show the changing trend of the number of sampled wavelengths，RMSECV values and the regression coefficient path of each wavelength with the increase of sampling runs，respectively

2.5 潛在變量數量的選擇

采用PLS法建立定量校正模型時，潛在變量（LVs）數量的選擇是否合適對于所建定量模型的預測性能影響較大，LVs數量太多會出現過擬合現象；LVs數量太少，則會導致建模信息不全，模型預測性能下降［32］。本研究采用“留一法”交互驗證選擇LVs數量，“留一法”交互驗證是對某一個LVs數量，從n個校正樣本中選取1個樣本進行預測，用n-1個樣本建立校正模型，預測留取的這一個樣本，經反復建模及預測，直至這n個樣本均被預測1 次且只被預測1 次，則得到對應這一LVs 數量的RMSECV，選擇最小RMSECV對應的LVs數量為最佳LVs數量。由圖3可知，當CARS-PLS模型的LVs數為7時（如圖3 中星號所示），RMSECV 最小。表3 中給出了DPPH、ABTS 和FRAP 的CARS-PLS 模型的最佳LVs 數量，分別為7、9和10。

表3 Full-PLS和CARS-PLS模型結果Table 3 Results of the Full-PLS and CARS-PLS models

圖3 DPPH的CARS-PLS模型在不同LVs數量下的RMSECV值Fig．3 RMSECV values at different numbers of LVs for DPPH CARS-PLS model

3 討 論

表3 給出了DPPH、ABTS 和FRAP 的Full-PLS 和CARS-PLS 建模結果，粗體表示最佳模型建模結果。可以看出，3 個抗氧化活性指標的CARS-PLS 模型均明顯優于Full-PLS 模型。RMSEP 分別由2．63%、0．89%和3．63μmol/L 下降至2．42%、0．73%和3．60 μmol/L。因此分別建立了DPPH、ABTS 和FRAP 的CARS-PLS 定量校正模型，校正模型參考值與預測值的相關性見圖4。圖4 中樣本的參考值與預測值均勻分布在回歸線兩側，3 個抗氧化活性指標CARS-PLS 模型的RC和RP均大于0．96，預測性能較高。

圖4 CARS-PLS模型參考值與預測值的相關性圖Fig．4 Correlation diagrams of reference values and predicted values for the CARS-PLS models

圖5 為預測集參考值與預測值的對比圖。圖中3 個抗氧化活性模型的近紅外預測值與參考值均十分接近，變化趨勢基本保持一致，表明預測集樣本各指標抗氧化活性的預測值與參考值之間呈現良好的相關性，3個模型均可準確預測羊棲菜的抗氧化活性。

圖5 預測集參考值與預測值的對比圖Fig．5 Comparison diagrams of reference values and predicted values of prediction sets

4 結 論

本研究采用NIRS 結合CARS 算法建立了一種快速測定羊棲菜抗氧化活性的方法。基于近紅外光譜和抗氧化活性指標建立PLS 定量模型，采用異常光譜識別方法、光譜預處理方法和建模變量選擇方法優化模型性能。結果顯示，所構建的3種抗氧化活性指標的CARS-PLS模型均可達到定量分析要求，RP均在0．96以上，證實了NIRS和CARS算法在羊棲菜抗氧化活性快速測定中的可行性。所構建的方法快速、便捷、環保，有助于提升羊棲菜的質量控制水平，推動我國羊棲菜走向國際市場。