吲哚結構的熒光探針在粘度檢測及細胞成像中的應用

余 強，李 祥，馬素芳

（1．山西醫科大學 醫學影像學院，山西 太原 030001；2．山西醫科大學 基礎醫學院，山西 太原 030001）

粘度作為細胞微環境的重要參數之一，不僅對細胞內信號轉導和新陳代謝具有重要意義，而且能夠通過影響活細胞內生物分子和化學信號的相互作用直接或間接影響細胞的各種生理功能，如自噬等［1-5］。此外，細胞內粘度的異常與許多疾病相關，如神經退行性疾病［6］、糖尿?。?］、癌癥［8］等，因此，檢測細胞內粘度的變化不僅對細胞生物學基礎研究具有重要意義，而且對相關疾病的診斷和治療具有非常重要的指導作用。

傳統的粘度檢測方法有毛細管、落球和旋轉粘度計法等，然而以上方法僅適用于宏觀流體粘度的檢測，且因檢測誤差大、取樣量多、會破壞生物樣品等缺陷，無法用于細胞微環境內粘度的檢測［9-11］。因此，亟需開發一種能夠檢測細胞微環境中粘度的新技術。熒光探針法是近年來興起的一種新型檢測技術，該方法具有操作簡便、靈敏度高、可實時檢測、非侵入式等優點，被廣泛應用于活性小分子的檢測［12-14］。近年來，熒光探針法與生物成像技術相結合，廣泛應用于細胞內生物標志物的實時檢測，大大加速了學者們對生物體內相關疾病發生和發展過程的了解，為疾病的精準診斷和治療開辟了新方法［15-17］。其中，用于粘度檢測的熒光探針也被相繼開發［18-20］。然而，熒光成像技術用于細胞微環境粘度檢測時，熒光探針常受到細胞微環境中pH值、極性以及細胞內活性物質的干擾。因此，構建一種特異性強、穩定性好的粘度探針是當前需解決的難點之一。此外，目前已報道的絕大多數粘度探針合成過程復雜，探針的純化常需經過柱層析，甚至重結晶等方法，提高了探針制備成本。通過一步合成法構建特異性粘度探針，并減少其純化過程是當前探針領域需解決的關鍵科學問題之一。2022年，董川課題組報道了一種線粒體靶向的近紅外熒光探針，并實現了脂肪肝組織、炎癥小鼠等模型中粘度的實時、原位和可視化檢測［21］。

粘度響應的熒光探針的作用機制主要有以下幾種：（1）分子內電荷轉移（ICT）機理。該類探針一般具有D（電子供體）-π-A（電子受體）的結構特點。當探針分子識別粘度后，分子體系的推拉電子能力發生改變，導致其最佳吸收光譜和最佳熒光發射光譜發生變化，進而可通過光譜改變判斷探針分子對粘度的識別能力。如林偉英課題組構建了一類基于ICT 機理的陽離子粘度探針，該探針可用于活細胞和斑馬魚線粒體中粘度的可視化檢測［22］。（2）熒光共振能量轉移（FRET）機理?；贔RET 識別機理的粘度探針，其最大的結構特點是供體的最佳發射波長和受體的最佳吸收波長具有一定的重疊，導致體系發生非輻射能量躍遷，進而實現對粘度的檢測。如林偉英課題組報道的基于FRET 識別機理的比率型熒光探針，成功應用于線粒體中粘度的定量檢測［23］。（3）扭曲分子內電荷轉移（TICT）機理。大多數粘度探針基于該機理構建，此類探針一般具有可旋轉的D-π-A結構，高粘度環境將限制分子結構中碳碳鍵的自由旋轉，從而增大分子結構的共軛程度，導致其熒光增強。如唐波課題組報道的花菁類粘度探針，可通過TICT機理有效識別粘度，并成功應用于活體小鼠血栓中粘度的檢測［24］。

基于TICT 機理構建的熒光探針，通常具備可旋轉的D-π-A 結構，且對粘度介質具有較好的響應性。本文以吲哚作為電子供體，半花菁作為電子受體，通過Knoevenagel縮合反應制備了一種具有D-π-A結構的熒光探針1，并用于細胞中粘度的檢測，系統研究了探針熒光強度隨細胞粘度的變化。結果表明，隨著體系粘度的增加，探針的熒光強度逐漸增強。此外，該探針對粘度具有較好的特異性，能夠通過生物熒光成像實現對細胞中粘度變化的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse 型熒光光譜儀（美國Varian 技術有限公司）；Bruker AVANCE Ⅲ 400 MHz 核磁共振儀（德國Bruker公司）；6210型質譜儀（安捷倫科技公司）；SGW? X-4顯微熔點儀（上海儀電物理光學有限公司）；FV3000激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

用于合成的原料化合物均購自安徽澤升科技有限公司；生物試劑魚藤酮和羰基氰化氯苯腙（CCCP）購自上海邁瑞爾生化科技有限公司；人宮頸癌細胞（HeLa cells）購自中國科學院細胞庫。

1.2 探針的制備

探針1的合成路線如圖1所示。

圖1 探針1的合成路線Fig．1 Synthetic route of probe 1

將1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物（1．0 g，2．8 mmol）和3-甲酰基吲哚（0．7 g，3．9 mmol）溶于乙醇中，回流反應5 h。濃縮反應液并抽濾，所得固體用無水乙醇重結晶，得到的熒光探針1 為橙色固體（0．5 g，收率33%）。

1.3 細胞毒性實驗

將HeLa 細胞接種于96 孔板中后，在37 ℃、5% CO2的環境中孵育24 h 待其貼壁。棄去原有培養液，分別向實驗組加入濃度為2、4、6、8、10、15、20、25、30 μmol/L的探針溶液100 μL，繼續孵育24 h。將含有探針的培養液棄去，向每孔中加入3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液（0．5 mg/mL）100 μL，培養4 h后，再將二甲基亞砜（DMSO，100 μL）分別加入到實驗組和對照組中，置于搖床上振蕩15 min后，用酶標儀測定每孔于490 nm處的吸光度值。

1.4 細胞熒光成像實驗

將HeLa細胞接種于培養皿中，置于培養箱中孵育24 h待其貼壁后分為3組。第1組細胞中加探針溶液（20 μmol/L，1 mL）培養30 min；第2組細胞中先加CCCP 溶液（10 μmol/L，1 mL）培養10 h后，再加探針溶液（20 μmol/L，1 mL）繼續培養30 min；第3組細胞中先加魚藤酮溶液（10 μmol/L，1 mL）培養8 h后，再加探針溶液（20 μmol/L，1 mL）繼續培養30 min。培養完成后將3組細胞中的溶液分別棄去，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3 次，4%多聚甲醛固定15 min，重新加入PBS，在激光共聚焦顯微鏡下進行細胞熒光成像實驗。

2 結果與討論

2.1 探針分子結構表征

探針分子采用核磁氫譜（1H NMR）、核磁碳譜（13C NMR）、質譜（ESI-MS）和紅外光譜（IR）進行表征，并進行熔點測定。結果如下：1H NMR（400 MHz，DMSO-D6）：δ8．71（s，1H），8．67（s，1H），8．29-8．26（m，1H），7．81-7．75（q，J=8．0 Hz，2H），7．63-7．61（m，1H），7．59（t，J=8．0 Hz，1H），7．51（t，J=8．0 Hz，1H），7．40-7．38（m，2H），7．21（d，J=16．0 Hz，1H），4．01（s，3H），1．81（s，6H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-D6）：δ180．67，149．34，142．92，142．55，138．84，128．01，124．91，123．6，123．15，114．06，113．97，106．58，51．35，33．52，26．87；IR（cm-1）：3 427，3 118，1 577，1 480，1 405，1 239，820，751；EST-MS（m/z）：C21H22IN2計算值：429．082 8，實測值：429．084 0［M+H］+；熔點為276～277 ℃。

1H NMR 中，1．81 nm處為吲哚鹽部分C3原子所連2個—CH3的H，4．01 nm處為吲哚鹽部分N原子所連—CH3的H，7．21 nm 處為π 橋碳碳雙鍵的H；IR 結果顯示，3 427、3 118 cm-1處為N—H 鍵的伸縮振動峰，1 577、1 480 cm-1處為苯環碳碳骨架的振動峰，820 cm-1處為π 橋中碳碳雙鍵所在碳的碳氫振動峰，751 cm-1處為苯環上的四氫峰。ESI-MS 也準確測定出化合物的相對分子量。

以上表征數據均證明探針分子成功制備。

2.2 探針的光學性能研究

2.2.1 熒光探針的粘度響應性研究為了考察探針對粘度的響應性能，分別測定了探針在不同比例（g∶g）的水-甘油體系中的熒光發射強度。如圖2A 所示，隨著體系粘度的逐漸增加，探針（λem= 517 nm）的熒光強度逐漸增強。與純水體系相比，90%甘油體系的熒光強度增強了約100 倍，可能原因是，高粘度環境下，探針受體吲哚鎓鹽和供體吲哚環之間C—C單鍵的自由旋轉受限，使得整個分子能夠共平面，導致其熒光增強。此外，根據F?ster-Hoffmann 方程可知［25］，探針熒光強度的對數與體系粘度的對數具有較好的線性擬合關系（r2= 0．998 0，圖2B），且檢出限（3σ/k）為1．167 cP。以上結果表明所合成的探針對于粘度檢測具有較高的靈敏度，有望用于微環境中粘度的檢測。

圖2 不同比例H2O-甘油體系中探針1的熒光發射光譜（A）及探針1熒光強度對數與體系粘度對數的線性關系（B）Fig．2 Fluorescence emission spectra of probe 1 in different ratios mixture of water-glycero（lA）and linear relationship between lgI and lgη（B）cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.2.2 熒光探針的選擇性為了考察探針對粘度的選擇性，在探針水溶液中分別加入不同的活性小分子、離子等，并測定體系的熒光強度，結果如圖3A 所示：當探針水溶液中加入其它小分子或離子后，體系的熒光強度未發生明顯改變，僅在甘油溶液中的熒光強度明顯增強。此外，通過測定探針在不同溶劑體系中的熒光強度，發現其僅在甘油體系中的熒光明顯增強，而在其它溶劑中的熒光強度均無明顯變化（圖3B）。由此可見，探針受其它物質或周圍環境的影響較小，對粘度具有較好的選擇性，具有檢測細胞微環境中粘度變化的潛質。

圖3 探針1在不同干擾物（A）及不同溶劑（B）中的熒光光譜Fig．3 Fluorescence spectra of probe 1 in the presence of various analytes（A） and in different solvents（B）cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.2.3 熒光探針的穩定性由于細胞內環境組成復雜，一種性能優良的粘度響應熒光探針還應具備良好的光穩定性和pH 值穩定性。為考察探針的光穩定性和pH 穩定性，分別測定了室溫光照下探針水溶液及探針的90%甘油-水溶液在不同時間的熒光強度，結果如圖4A 所示。由圖可知，兩種體系中探針的熒光強度在60 min 內均未發生明顯改變。此外，對探針水溶液及探針的80%甘油-水溶液在不同pH 值下的熒光強度進行檢測，結果如圖4B 所示。在pH 4．0～9．0 范圍內，探針的熒光強度均未發生明顯變化。以上結果顯示探針本身及其響應粘度后的熒光強度均不受光照和pH值的影響，說明探針具有較好的光穩定性和pH值穩定性。

圖4 光照（A）及pH值（B）對探針熒光強度的影響Fig．4 Effects of light（A） and pH values（B） on fluorescence of probe 1 cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.3 探針的生物應用

2.3.1 熒光探針的細胞毒性研究利用MTT 法測定了不同濃度的探針溶液對細胞存活率的影響。將不同濃度（0～30 μmol·L-1）的探針溶液分別置于HeLa 細胞中培養24 h 后，細胞的存活率均達到85%以上（圖5），證明探針溶液的濃度對細胞存活率影響不大，可應用于細胞微環境中粘度的檢測。

圖5 HeLa細胞在不同濃度探針1中的存活率Fig．5 The viabilities of HeLa cells in different concentrations of probe 1

2.3.2 細胞熒光成像研究探針響應粘度主要通過熒光強度變化進行。基于此，將HeLa 細胞與探針溶液共孵育30 min，可觀察到微弱的熒光（圖6A）；分別將CCCP 或魚藤酮兩種藥物作用于HeLa細胞一段時間后，再加入探針溶液孵育30 min，可觀察到細胞熒光強度明顯增加（圖6B、圖6C、圖6D）。這是因為CCCP和魚藤酮均可導致細胞線粒體功能異常，進而引起細胞微環境的粘度增加。藥物刺激誘導細胞前后，探針所呈現的明顯的熒光增強現象表明該探針可對細胞微環境中的粘度變化進行有效檢測。

圖6 HeLa細胞的熒光成像Fig．6 Fluorescence imagings of HeLa cells A． cultured with probe 1（20 μmol/L） for 30 min；B． incubated with CCCP（10 μmol/L） for 10 h，and then incubated with probe 1（20 μmol/L）for another 30 min；C． incubated with rotenone（10 μmol/L） for 8 h，and then incubated with probe 1（20 μmol/L） for another 30 min；D． relative fluorescence intensity comparison of A，B and C，scale bar：20 μm

3 結 論

以1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物為電子受體，吲哚為電子供體，通過一步反應成功制備了具有D-π-A結構的熒光探針。通過考察探針的光學性質及細胞成像情況，系統探究了探針對不同粘度的響應性能及其對細胞中粘度變化的檢測能力。結果表明，探針的熒光強度隨著細胞粘度的增加而增強，且不受其它物質的干擾，探針對粘度具有較好的特異性。此外，探針對細胞的毒性較小，可以靈敏地檢測藥物刺激后細胞的粘度變化，證明該探針有進一步應用于生物體內粘度檢測的潛力。