基于無掩膜光刻法的紙基微流控芯片制備與驗證研究

張 嚴，樸林華，佟嘉程，馬炫霖，劉珺宇

（北京信息科技大學 北京傳感器重點實驗室，北京 100101）

微流控芯片是指通過微加工技術將微驅動泵、微儲液池、微流體管路、微開關、微檢測元器件和連接器等功能元件高度集成在微芯片材料上的微全分析系統［1］。其可以替代傳統的大型檢測儀器，縮短檢測時間以及減少試劑用量［2］。微流控芯片的基底材料包括硅、玻璃和聚合物。硅材料因具有優良的化學惰性和熱穩定性而最早被研究人員用于制備微流控芯片的基底材料，但其由于易碎、透光性差、價格昂貴、表面化學改性困難而逐漸被玻璃所取代［3］。玻璃廉價易得，具有優良的光學性能和電滲特性，但其加工制備較復雜，需使用具有一定危險性的化學品進行刻蝕［4］。聚合物價格低廉，具有良好的透光性和電絕緣性，易改性且適合細胞培養和規模化生產，但其存在與大多數有機溶劑不相容、成本高等問題［5］。紙基微流控芯片是以濾紙代替硅、玻璃和聚合物等基底材料，采用光刻、蠟印、噴墨打印等技術制備成具有親疏水交替結構的微流控芯片［6］。相對于其他材料制備的微流控芯片，紙基微流控芯片具有成本低、制備簡單、尺寸小、便于攜帶、分析速度快、生物兼容性好、樣品試劑消耗少、無需額外的流體驅動裝置、環境可降解、可實現多目標物同時檢測，以及可集成多種檢測方式等優點［7-8］。基于紙芯片的諸多優勢，可將其廣泛應用于醫學診斷、環境檢測和食品安全等領域。

紙基微流控芯片的制備原理是通過物理或者化學手段填充纖維紙的空隙或者對纖維素進行改性從而圖案化紙基材料，在紙基材上構建允許流體定向流動的親疏水通道。常見的制備方法包括光刻法［9］、蠟印法［10］、噴墨打印法［11］、激光打印法［12］、等離子體處理法［13］等。其中光刻法相對于其他幾種方法具有較高的加工精度，且最小通道寬度可達微米級別，可廣泛用于微小尺寸和高精度的紙芯片制備。2007 年Whitesides 課題組［14］首次提出了使用光刻法制備紙芯片，并將其成功用于葡萄糖和蛋白質的檢測。此后，王方方等［15］利用光刻法制備了紙芯片并將其用于葡萄糖和尿酸的檢測研究，Kamali 等［9］成功利用光刻法制備紙基微流控芯片，并探究了不同工藝參數對通道質量的影響，實現最小100 μm的通道寬度。但以上研究的光刻技術在制備紙芯片時需提前定制特定的掩膜版，整個工藝流程復雜、耗時、成本高昂，且每一次更改紙芯片結構均需重新制作掩膜，欠缺靈活性。

本文提出了無掩膜光刻法制備紙基微流控芯片，首先使用L-edit 軟件設計紙芯片的版圖結構，并通過光刻工藝將設計的版圖結構轉移到濾紙上，考察了不同曝光時間對紙芯片微通道親疏水性能的影響，通過接觸角測量實驗探究疏水圖案的疏水程度，并利用無掩膜光刻技術制備的紙芯片進行亞硝酸鹽的檢測研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Whatman No．1 濾紙（美國丹納赫集團），硅片（寧波江北賽邦晶圓電子材料經營部），膠棒（Jong le Nara Co．，Ltd．），RFJ-220瑞紅光刻膠、RFX-2277負膠顯影液（瑞紅電子化學品股份有限公司），KW-4B型臺式勻膠機、SC-H-II型烤膠機（北京賽德凱斯電子有限責任公司），計時器（廣州星威電子實業有限公司），無掩膜光刻機（中國科學院光電技術研究所），超聲清洗機（深圳市春霖清洗設備有限公司），移液槍（上海力辰邦西儀器科技有限公司），亞硝酸鹽標準溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心），磺胺（天津大茂化學試劑廠），鹽酸萘乙二胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），電子天平（上海菁海儀器有限公司），藥匙（泰州市培正科教儀器有限公司），棕色容量瓶（江蘇華鷗玻璃有限公司）。

1.2 紙基微流控芯片的制備

紙芯片的制備基于RFJ-220 瑞紅負性光刻膠，負性光刻膠在前烘時會蒸發掉部分溶劑提高光引發劑的含量，在曝光時負性光刻膠受到光照發生交聯反應形成致密的交聯網絡，而未曝光的區域則會在顯影時被顯影液除去從而恢復紙的親水性，形成具有親疏水區分的紙芯片，隨后使用紫外接觸角測量儀對疏水區域的接觸角進行測量，并使用顯微鏡對制造的紙芯片進行顯微觀測。紙芯片的制備工藝流程如下：

①使用L-edit 軟件繪制紙基微流控芯片結構的數字掩膜；將濾紙剪裁成4 寸硅片大小并平整粘貼于硅片表面；

②將芯片放入勻膠機，設定轉速為慢速50 r/s，高速750 r/s，進行勻膠；

③將勻膠后的芯片放在熱臺上，105 ℃烘烤60 s，部分蒸發光刻膠中的溶劑；

④將烘烤后的芯片取下，冷卻后放入光刻機工作臺上，并設定曝光時間5 s，膠面設置95．8；

⑤將正面曝光后的芯片揭下翻轉粘貼在硅片表面，放入光刻機中再次進行反面曝光；

⑥將曝光完成的芯片取出放入培養皿中，倒入顯影液充分去除未參與曝光部分紙表面的光刻膠，從而恢復紙的親水性；

⑦將顯影后的紙芯片用水沖洗并放在熱臺上105 ℃烘烤3 min。

1.3 紙基微流控芯片檢測亞硝酸鹽

首先配制亞硝酸鹽標準濃度梯度液和檢測試劑Griess試劑。將100 μg/mL亞硝酸鹽標準樣液加水進行稀釋得到質量濃度分別為0、1、3、5、10、15、20 μg/mL 的亞硝酸鹽標準梯度液。Griess 試劑由磺胺溶液（A 液）和鹽酸萘乙二胺溶液（B 液）按1∶1 混合組成。A 液：稱取0．5 g 磺胺充分攪拌使其溶解并定容于50 mL 棕色容量瓶中儲存備用。B 液：稱取0．5 g 鹽酸萘乙二胺加入適量水，攪拌使其充分溶解后定容于50 mL 棕色容量瓶中避光存儲。使用移液器將0．5 μL 的B 液滴加在紙芯片的檢測區，真空干燥5 min；然后在紙芯片的進樣區滴加6．5 μL 亞硝酸鹽溶液，待亞硝酸鹽溶液通過紙芯片通道流至檢測區時，在檢測區滴加0．5 μL 的A 液。磺胺在酸性環境下與亞硝酸鹽發生重氮反應，生成瞬態重氮鹽，之后與預先干燥沉積的鹽酸萘乙二胺反應生成紫紅色絡合物，故在檢測區可觀察到顏色紫紅色的變化，即可證明亞硝酸鹽的存在。在滴加A液后等待5 min，然后將紙芯片置于暗箱中以閃光燈作為光源使用手機進行拍照，將反應產生的顏色圖像上傳至計算機，使用Photoshop軟件進行處理得到不同濃度亞硝酸鹽溶液產生顏色變化后對應的灰度值，從而建立亞硝酸鹽濃度與其顏色灰度值的對應關系。

1.4 紫外可見分光光度法檢測亞硝酸鹽

分別將各質量濃度梯度的50 μL 亞硝酸鹽溶液與3 mL Griess 試劑加至比色皿中進行混合，將3 mL水加至比色皿中作為參比溶液。設定紫外可見分光光度計的掃描波長為200～700 nm，得到各濃度對應的掃描曲線，取掃描245 nm 處對應的吸光度值與亞硝酸鹽濃度建立對應關系，驗證紙芯片檢測法與分光光度法的一致性。上述方法均在同一實驗室環境下進行。

2 結果與討論

2.1 紙芯片的制造

采用無掩模光刻法制備的紙基微流控芯片如圖1A所示，紙芯片由進樣區（邊長4 mm）、流道（長度4 mm）和比色檢測區（邊長3 mm）組成，整個紙芯片的樣本容量約10 μL。從圖中可以看出紙芯片的邊界和通道結構清晰，疏水壁壘呈現深黃色，其他區域為白色。采用紫外接觸角測量儀對疏水壁壘進行測量得到疏水區域的接觸角為100．62°（如圖1B），表明采用無掩模光刻法制備的紙芯片疏水區域具有非常好的疏水性。深黃色的疏水壁壘是由于負性光刻膠在光刻機中受到曝光發生交聯反應形成的交聯網絡，而白色的親水區域則是未參與反應的光刻膠在顯影時被顯影液去除從而恢復白色的紙纖維。將芯片置于顯微鏡下進行觀測（如圖1C），紙在恢復親水性時仍殘留部分光刻膠無法去除干凈，紙纖維呈淡黃色，因此液體在其上的流動速度下降，但下降程度在可接受范圍內，不影響紙芯片的使用。同時可以看到曝光后形成的交聯網絡非常致密緊實，形成了較強的疏水屏障。

圖1 紙基微流控芯片（A），疏水壁壘的接觸角（B）及光刻后濾紙的顯微觀測圖（C）Fig．1 Paper-based microfluidic chip（A），contact angle of hydrophobic barriers（B），and microscopic observation of filter paper after photolithography（C）

2.2 制備條件的優化

采用相同的制備工藝，在同一張紙基底上分別采用1 、2 、3 s的曝光時間對芯片進行正反面曝光，并在光刻后的紙芯片親水區域內分別滴加10 μL 墨水進行測試，探究不同曝光時間對疏水屏障疏水強度的影響（見圖2）。結果顯示，在進樣區滴加墨水后，1 s 曝光時間產生的疏水圖案處液體發生滲漏，疏水屏障未起到良好的疏水作用。2 s 和3 s 曝光時間產生的圖案則具有良好的疏水作用，可阻擋液體流出屏障并沿既定的圖案流至整個區域，且芯片蔬水區域的接觸可達100．56°。實驗結果表明曝光時間過短會導致交聯反應不充分，無法充分形成阻擋液體流動的交聯網絡，過長則會導致交聯反應過重，從而對圖案邊緣產生影響，不利于顯影時恢復紙的親水性，也延長了制備時間。實驗最終選擇最佳曝光時間為2 s。

圖2 曝光后墨水流動測試圖Fig．2 Ink flow test chart after exposure

2.3 紙芯片特征尺寸研究

紙基微流控芯片通常需要紙芯片具有更小的芯片結構以減少檢測試劑的量，同時減小芯片的尺寸以集成更多的芯片。本文采用無掩膜光刻法制作紙芯片，設計通道寬度分別為90 μm 和100 μm，采用“1．2”的制作工藝進行無掩膜光刻，烘干后使用顯微鏡觀察和測量芯片的通道寬度，并分別在每個芯片的進樣區滴加10 μL 黑色墨水（見圖3）。結果顯示，墨水在100 μm 的通道中可以很好的流動，但在90 μm 的通道中流動受阻。采用顯微鏡對100 μm通道進行測量，得到紙芯片最小親水通道的實際寬度為（68±5） μm。

圖3 不同通道寬度的紙芯片液體流動情況Fig．3 Liquid flow of paper chips with different channel widths

為獲得更小的芯片尺寸，不僅要盡量減小親水通道的寬度，疏水屏障的寬度同樣具有重要影響。采用相同的芯片結構分別設計寬度為70、80、90 μm 的疏水屏障，采用“1．2”的紙芯片制作工藝，并在親水區域滴加5 μL黑色墨水，液體的流動情況如圖4所示。70 μm寬的疏水屏障未能阻擋液體的流動，而80 μm和90 μm寬的疏水屏障具有阻擋液體流動的效果。使用顯微鏡對加工后的實際芯片疏水屏障進行測量，結果顯示采用無掩模光刻法制作的紙芯片的最小疏水屏障寬度為（104±9）μm。

圖4 液體在不同寬度疏水屏障中的流動情況Fig．4 Flow of liquids in hydrophobic barriers of different widths

實驗顯示，顯影干燥后，紙芯片的實際親水通道寬度小于設計寬度，疏水屏障寬度大于設計寬度。這可能是因為曝光后的疏水屏障和未曝光區域在顯影液和水中具有不同的變形量，所以導致干燥后紙芯片的疏水屏障變大，而親水通道變小。

2.4 亞硝酸鹽的測定

采用紙芯片法進行亞硝酸鹽檢測，結果如圖5 所示。從圖中可以看出亞硝酸鹽和檢測試劑反應后發生顏色變化，且隨著亞硝酸鹽濃度的增大顏色由淺粉色變成紫紅色。使用Photoshop 軟件對手機拍攝的顯色結果進行分析，得到不同濃度（1、3、5、10、15、20 μg/mL）亞硝酸鹽溶液及其對應的灰度值。結果顯示，在1～20 μg/mL范圍內二者具有良好的線性關系，線性方程為Y=3．450X+34．83，r2=0．977 0。采用相同的紙芯片和實驗方法重復檢測10 μg/mL亞硝酸鹽溶液3次，顯色后的顏色強度平均值為73．6，標準誤差為0．98。

圖5 紙芯片法檢測亞硝酸鹽的顯色結果及線性曲線Fig．5 Color development results and linear curve of nitrite detection by paper chip method

紫外可見分光光度計檢測亞硝酸鹽濃度是一種被廣泛認可的方法（如圖6A），從圖中可以觀察到不同質量濃度亞硝酸鹽溶液在245 nm 和540 nm 處有明顯吸收峰，且以245 nm 處的吸光度最大。將亞硝酸鹽溶液質量濃度（1、3、5、10、15、20、25 μg/mL）與其在245 nm 的吸光度建立對應關系，結果顯示在1～25 μg/mL范圍內二者具有良好的線性關系（圖6B），線性方程為Y=0．011 56X+3．180，r2=0．992 3。方法用于亞硝酸鹽的檢測，檢測結果與紙芯片法 具有良好的一致性。

圖6 不同質量濃度亞硝酸鹽在200～700 nm波長下的掃描曲線（A）及不同質量濃度亞硝酸鹽在245 nm處的吸光度（B）Fig．6 Scan curves of nitrite different concentrations at 200-700 nm（A） and absorbance values of nitrite with different concentrations at 245 nm（B）

3 結 論

本文提出了一種基于無掩膜技術的新制備方法，采用該方法制備的紙芯片具有明顯的親疏水區分，無需制作特制的掩膜版，僅需2 s 的曝光時間就可以形成較強的疏水屏障，疏水區域的接觸角達100．56°。該方法制備的紙芯片最小可實現的疏水屏障寬度為（104±9） μm，最小可實現的親水通道寬度為（68±5） μm，將紙芯片用于亞硝酸鹽的檢測，得到亞硝酸鹽和顯色圖像灰度值之間具有良好的線性關系，線性方程為Y=3．450X+34．83，r2=0．977 0，檢測結果與分光光度計法具有良好一致性。該方法具有加工精度高、制造簡便、工藝流程簡單、時間短及便于攜帶等優點，制備的紙芯片還可用于基于顯色反應的多種物質檢測，具有廣泛的應用范圍和良好的使用前景。