不同產地白術飲片HPLC指紋圖譜研究

侯曉杰 鄭英 李瑋 張建鋒

【摘 要】 目的：通過對不同產地白術飲片研究，建立白術飲片高效液相指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱：Agilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫（0～10 min，50%～70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），流速為1.0mL·min-1，柱溫為25 ℃，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ檢測波長為220 nm，白術內酯Ⅱ檢測波長為276 nm，進樣量20 μL。以2號峰白術內酯Ⅲ為參照， 記錄12批次白術飲片的HPLC圖譜，然后將其導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統2012版》（國家藥典委員會），采用指紋圖軟件確定共有峰。結果：建立12批白術飲片的HPLC指紋圖譜，標定12個共有峰，相似度均大于0.90。經驗證，與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結論：研究建立HPLC指紋圖譜可用于白術飲片質量控制方法，同時也為白術飲片質量評價提供科學依據。

【關鍵詞】 白術飲片；高效液相色譜法； 指紋圖譜；白術內脂

【中圖分類號】R284.1? ?【文獻標志碼】A? ? 【文章編號】1007-8517（2023）14-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202314011

Abstract：Objective To establish a high performance liquid fingerprint of Atractylodes macrocephala.Methods HPLC method was used. Column： Agilent C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm），mobile phase： acetonitrile-water，gradient elution （0-10 min，50%-70% A;10-20 min，70%-80% A） ，20～30 min; 80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），the flow rate is 1.0 mL·min-1，the column temperature is 25 °C，atractylenolide I，atractyl lactone III The detection wavelength was 220 nm，the atractylenolide II detection wavelength was 276 nm，and the injection volume was 20 μL. Taking the bergenin as a reference，the HPLC chromatogram of 12 batches of decoction pieces was recorded，and then introduced into the Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software System 2012 Edition （National Pharmacopoeia Commission） to determine the common peak.Results There were 12 common peaks in the HPLC fingerprints of 12 batches of Atractylodes macrocephala. The similarity was greater than 0.90. It has been verified that it has good consistency with the control fingerprint.Conclusion The HPLC fingerprint of this study can be used to control the quality control of Atractylodes macrocephala L.，and also provide reference for the quality evaluation of Atractylodes Rhizome.

Keywords：Atractylodes Macrocephala; High Performance Liquid Chromatography; Fingerprint; Atractylodes

白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖。臨床上白術炮制品主要有麩炒白術、土炒白術和焦白術等飲片，麩炒白術表面焦黃色或黃棕色，偶見焦斑，略有焦香氣，具有緩和燥性、健脾消脹之功效，用于脾胃不和、運化失常、倦怠乏力和表虛自汗等癥狀［2-4］；土炒白術表面杏黃土色，附有細土末，有土香氣，具有補脾止瀉之功效，用于脾虛食少、泄瀉便溏、胎動不安等癥狀［5-7］；焦白術不規則厚片，表面焦褐色，斷面焦黃色，質松脆，略有焦香氣，焦白術具有補氣健脾、澀腸止瀉的作用，主要用于慢性寒性腹瀉［8-10］。因此，課題對不同區域白術飲片開展研究，建立指紋圖譜共有模式，用于白術飲片質量控制，為白術質量評價提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀（賽默飛）；JT5003千分之一電子天平（余姚市金諾天平儀器公司）；ME204E萬分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），AUW220D十萬分之一電子分析天平（蘇州島津儀器有限公司）；LDP-150高速萬能粉碎機（浙江永康市紅太陽機電有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料 白術內酯Ⅰ對照品（批號：111975-201501）、白術內酯Ⅱ對照品（批號：111976-201501）、白術內酯Ⅲ對照品（批號：111978-201501）均購于中國食品藥品檢定研究院，以上對照品均供含量檢測用。甲醇（色譜純，天津科密歐公司）；乙腈（色譜純，天津科密歐公司）；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

收集不同產地的白術飲片，經貴州中醫藥大學生藥教研室魏升華教授鑒定為菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.經加工制成的飲片。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫（0～10 min，50%-70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），流速為1.0 mL.min-1，柱溫為25 ℃，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ檢測波長為220 nm，白術內酯Ⅱ檢測波長為276 nm，進樣量20 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱定白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ對照品適量，用甲醇溶解配制成質量濃度濃度分別為1.20 μg/mL、4.40 μg/mL、2.22 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱定白術飲片粉末（過3號篩）約0.5 g，置具塞錐形瓶中，準確加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）40 min，取出，放置至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足質量，搖勻，過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取白術藥材粉末依照“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下，連續進樣6次，以2號峰白術內酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和峰面積，其結果分別為1.3%和1.9%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取白術藥材粉末6份，并依照“2.2.2”項下方法制備供試品平行溶液，按“2.1”項色譜條件下分別進樣測定，以2號峰白術內酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和峰面積，其結果分別為1.7%和2.2%，表明此方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取白術藥材粉末依照“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，以2號峰白術內酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對保留時間和峰面積，其結果分別為1.6%和2.1%，表明24 h內樣品溶液的成分穩定。

2.4 白術HPLC指紋圖譜的建立及技術參數

2.4.1 白術HPLC指紋圖譜的比較和分析 采集于我國不同地區的12批白術飲片，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣，記錄HPLC指紋圖譜，然后將12批飲片的指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統2012版（國家藥典委員會）。進行色譜峰匹配，并生成對照指紋圖譜，以建立的共有模式為參照圖譜計算1～12批樣品的相似度。

2.4.2 色譜峰指認 對不同的供試品色譜圖的檢測結果進行比較，本試驗標定了12個指紋圖譜中的共有峰，如圖1所示，與混合對照品的指紋圖譜進行比對，確認了2號峰白術內酯Ⅲ、5號峰為白術內酯Ⅰ、8號峰為白術內酯Ⅱ。從相似度數據（表2）和圖2中可以看出不同地區的白術飲片相似度在0.963～0.999之間，均大于0.9，說明不同產地的白術所含化學成分大致相同。

2.4.3 白術參照峰的標定 通過對12批不同產地白術飲片指紋圖譜的測定結果進行比較，確定了12個色譜峰為共有峰，并選擇了2號峰白術內酯Ⅲ作為參照峰。在白術藥材指紋圖譜中白術內酯Ⅲ保留時間適宜，峰形較穩定，白術內酯Ⅲ也是白術藥材的主要成分之一，并且在所有白術飲片中為共有峰，因此選定白術內酯Ⅲ為參照峰。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本試驗利用紫外-可見分光光度計對白術樣品溶液進行全波長掃描，經波長掃描發現白術樣品溶液分別在243 nm，292 nm，376 nm 3個波長處有吸收。并利用高效液相色譜液對各波長進行考察。發現當檢測波長為243 nm時，基線較穩定，呈現的吸收峰較多，峰面積相對較大，分離度好，峰形對稱。本試驗通過全波長掃描得到，樣品在3個波長下有吸收，分別對3個波長進行比較，最終選擇243 nm作為白術指紋圖譜檢測波長。

3.2 洗脫方式的選擇 在實驗過程中，選擇等度洗脫和梯度洗脫兩種方式進行研究， 當使用等度洗脫，色譜峰在分離過程中分離度不理想，所以考慮使用梯度洗脫，以色譜峰的分離度和保留時間為指標，確定最終洗脫方式為梯度洗脫。

3.3 提取溶劑的選擇 取白術粉末約1.0 g，精密稱定，分別以甲醇和乙醇進行超聲提取。以考察甲醇、乙醇作為提取的溶劑對白術樣品溶液的指紋圖譜，結果兩種提取溶劑對白術樣品差異不明顯，且乙醇毒性較小，故本試驗選擇用乙醇進行提取。

3.4 提取溶劑質量分數的選擇 本試驗分別以100%、80%、60%乙醇作為溶劑考察對白術指紋圖譜的影響。顯示用100%乙醇作提取溶劑時，峰分離度較好，吸收較大，信息量大，故本試驗選擇用100%乙醇進行提取。

3.5 料液比的選擇 本試驗對比不同料液比的提取溶劑對白術進行提取，分別考察料液比為1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10對白術樣品指紋圖譜的影響。發現當料液比為1∶20時，峰分離度較好，吸收較大，信息量大，故選擇1∶20為最佳料液比。

3.6 提取時間的選擇 為了得到較好的提取效果，經查閱相關文獻資料［7-8］，本試驗分別考察超聲提取60 min、40 min、20 min對白術樣品的影響，當提取時間為40 min時峰分離度較好，吸收較大，信息量大，本試驗以超聲40 min來進行提取。

3.7 提取方法的選擇 以文獻中查閱的方法為依據［9-10］，分別進行回流提取、超聲提取兩種方法考察，分別比較兩種提取方法下指紋圖譜，結果顯示，兩種提取方法對白術指紋圖譜色譜圖無明顯差異，為了操作方便，節約時間故選擇超聲提取。在研究白術指紋圖譜提取方法時，分別從樣品提取方法、提取溶劑、溶劑比例、提取時間進行了考察，通過試驗結果，最終確定提取方法為加入100%乙醇20 mL超聲40 min。

3.8 指紋圖譜結果分析 通過建立白術飲片指紋圖譜，對12批白術飲片指紋圖譜進行分析研究，發現白術飲片HPLC共有峰的相對峰面積和共有保留時間具有較好穩定性，12批飲片相似度均大于0.90，說明雖然產地不同，生長環境多樣化，但是白術的質量相對穩定。

綜上，研究根據市場調研情況，對全國白術的道地產區分別采集樣品進行研究，確保研究樣品具有道地性、真實性和代表性，全面系統考察了檢測波長、洗脫方式、提取溶劑、提取時間和料液比等條件，保證建立的方法較好的適用性和科學性。通過HPLC法對全國不同區域白術飲片進行研究，建立白術飲片指紋圖譜研究方法，采用指紋圖譜軟件標定12個共有峰，并選擇2號峰白術內酯Ⅲ作為參照峰，記錄12批次白術飲片的HPLC圖譜，其相似度均大于0.90，說明該方法具有較好的專屬性、重現性、穩定性和可控性，可作為白術種質資源、開發應用、加工方法和飲片標準等研究提供研究基礎和技術方法，并能更加系統全面為白術相關的質量評價提供科學依據。

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（收稿日期：2022-11-05 編輯：陶希睿）