肌骨寧對去勢大鼠骨質疏松及肌萎縮的保護作用研究*

桑繼亮,馬江濤

1.開封市第二中醫院,河南 開封 475000; 2.河南省洛陽正骨醫院,河南省骨科醫院,河南 鄭州 450003

骨質疏松癥(osteoporosis,OP),是一種骨形成與骨吸收動態平衡紊亂的代謝性骨病,其特征是骨量降低、骨微結構破壞和骨脆性增加,由此引發的脆性骨折或骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)不僅導致橈骨遠端、腰椎和股骨頸骨折,還給家庭和社會帶來沉重的心理負擔和經濟負擔[1]。中國骨質疏松癥流行病學調查報告指出,我國50歲以上人群OP患病率為19.2%,男女比例為15;65歲以上人群OP患病率為32.0%,男女比例為15[2]。肌少癥(sarcopenia,SP)是以肌力、肌量和肌肉功能的漸進性和全身性下降為特征的全身性肌肉疾病,SP引起患者跌倒、骨折、住院、致殘和致死風險增加。由于SP診斷標準不一,其發病率范圍為8.55%～36.50%[3]。OP常常合并SP,到底是OP引起SP,還是SP引起OP,或者兩者同時發病,目前尚無定論。目前,國內外學者已開始關注骨質疏松合并肌少癥,即肌少-骨質疏松癥(osteosarcopenia,OS),然而受限于缺乏成熟的體內模型,本病的基礎研究一直無法廣泛開展。去勢模型(ovariectomy,OVX)是國內外研究絕經后OP的“金標準”,也是FDA和WHO推薦的研究絕經后OP的最佳模型,已被廣泛應用[4-5]。眾多研究表明,骨質疏松和肌萎縮之間存在復雜聯系[6-9],廢用性OP模型也表現出肌萎縮[10-11]。然而去勢模型除了骨質疏松,是否也能出現肌萎縮目前尚不清楚。本研究通過構建大鼠去勢模型并進行藥物干預,研究去勢對大鼠骨骼和肌肉的影響,以及肌骨寧對去勢大鼠骨質疏松及肌萎縮的保護作用。

1 材料

1.1 動物SPF級6月齡雌性SD大鼠60只,體質量300～350 g,購于河南省實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(豫)2017-0001。動物實驗方案經河南省洛陽正骨醫院動物實驗倫理委員會批準(批準號:KY2021-003-01)。大鼠于SPF級實驗室飼養,溫度(23±3)℃,濕度(50±10)%,每天光照 12 h,喂食普通飼料及無菌用水。

1.2 藥品和試劑肌骨寧(杜仲、菟絲子、黃芪、丹參、甘草)水煎劑由河南省洛陽正骨醫院中藥房提供;戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司,批號:國藥準字J20171038,規格:1 mg);氯化鈉注射液(廣西裕源藥業有限公司,批號:國藥準字H19010205);注射用青霉素鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司,批號:國藥準字H37020080)。40 ng·L-1多聚甲醛(蘭杰柯科技有限公司,貨號:BL539A);無水乙醇(上海科醚化學科技有限公司,貨號:C007983);新型脫鈣液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:E1171);蘇木素伊紅染液(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C0105M);大鼠血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)ELISA檢測試劑盒(上海滬鼎生物,貨號:D-30037);大鼠血清I型前膠原氨基端肽(type I procollagen amino terminal peptide,PINP)、I型膠原交聯羧基末端肽(type I collagen cross-linked carboxy terminal peptide,β-CTx)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA檢測試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司,貨號:MM-20710R1、MM-20172R1、MM-0197R1、MM-0575R1)。

1.3 儀器BSA124S型分析天平(德國賽多利斯集團);YLS-13A型大小鼠抓力測定儀(濟南益延科技發展有限公司);Discovery A型雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司);micro CT儀(瑞士Scanco Medical公司);JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司);RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);KD-P型組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司);CX43型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥60只雌性SPF級SD大鼠適應性飼養1周后,按隨機數字表法分為正常組、假手術組、模型組、肌骨寧組和雌激素組。除正常組及假手術組外,其余大鼠采用去勢法切除雙側卵巢,假手術組切除卵巢附近等量脂肪組織,逐層縫合肌肉和皮膚,術后每只大鼠肌肉注射青霉素鈉8萬單位,每天1次,連續3 d。造模3個月后,進行藥物干預,給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算,肌骨寧給藥劑量為2.083 g·kg-1·d-1,雌二醇給藥劑量為0.104 mg·kg-1·d-1,即肌骨寧組大鼠每天灌胃給予2.083 g·kg-1肌骨寧水煎劑,雌激素組大鼠每天灌胃0.104 mg·kg-1雌二醇溶液,其余組大鼠每天灌胃等體積的生理鹽水,灌胃體積為 10 mL·kg-1,連續灌胃3個月。

2.2 大鼠抓力檢測分別在造模前、用藥前和取材前測量大鼠前爪抓力。使用大小鼠抓力儀每周定時測量大鼠前爪抓力(forelimb grip strength)。測試前讓大鼠在抓力儀上適應3 min,然后快速抓住鼠尾,待大鼠前爪抓牢后,沿鼠尾輕輕地水平向后拉,使后肢懸空,連續測量3次,記錄儀器最大抓力讀數,用三次抓力的平均值反映前爪肌肉力量。

2.3 取材及相關臟器質量檢測麻醉大鼠后,腹主動脈采血,離心機分離血清,超低溫冰箱凍存。完整分離左側股骨、腓腸肌、比目魚肌、子宮、肝臟和腎臟等組織,剔除周圍組織,預冷PBS漂洗,吸水紙吸去表面水分,分析天平分別稱取子宮、肝臟和腎臟的質量。稱質量后放入10 mL離心管中,多聚甲醛固定。

2.4 雙能X線骨密度儀檢測麻醉大鼠后,用雙能X線骨密度儀“小動物”模式中“大鼠全身”和“區域高分辨率”分別測量大鼠全身骨密度(bone mineral density,BMD)、股骨BMD、瘦肉量、脂肪量、骨礦量和四肢瘦肉量等,計算大鼠全身骨礦含量(全身骨礦含量/體質量,bone mineral content,BMC)和脂肪含量百分比(全身脂肪含量/體質量,fat content,FAT)。根據多個肌少癥工作組制訂的標準[12-15],計算大鼠骨骼肌質量指數(全身骨骼肌量/體質量,skeletal mass index,SMI)和相對骨骼肌質量指數(四肢骨骼肌量/體質量,RSMI)。

2.5 micro CT檢測對離體股骨進行micro CT掃描,掃描條件設定為電壓80 KV,電流100 μA,掃描厚度為14 μm。通過儀器自帶分析軟件(CTAn)框取松質骨,選擇股骨遠端生長板上方1 mm的松質骨作為感興趣區,分析骨體積分數(bone volume fraction,BV/TV)、骨表面密度(bone surface density,BS/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(trabecular number,Tb.N)和骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp),并通過儀器自帶分析軟件(CTvox)重構股骨遠端三維圖像。

2.6 大鼠血清學檢測根據ELISA試劑盒說明,采用ELISA法檢測大鼠血清AKP、PINP、β-CTx、IGF-1、E2含量。

2.7 病理染色股骨遠端和腓腸肌先后進行HE染色,顯微鏡下觀察股骨遠端和腓腸肌的病理變化。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較實驗過程中,假手術組大鼠因術后傷口感染死亡1只,肌骨寧組大鼠因灌胃刺傷呼吸道死亡2只,最終納入研究的動物數量為57只。各組大鼠行為活動正常,毛發光澤干凈,飲食飲水正常,分泌物及二便正常。

3.2 各組大鼠子宮、肝臟和腎臟質量比較對各組大鼠的子宮、肝臟和腎臟質量檢測發現,模型組、肌骨寧組和雌激素組大鼠的子宮質量較正常組和假手術組降低,差異有統計學意義(P<0.05);而各組肝臟、腎臟質量無明顯變化,表明去勢可顯著引起大鼠子宮萎縮,而對肝臟和腎臟無影響,證明模型構建成功。見圖1。

注:A:肝臟質量比較;B:腎臟質量比較;C:子宮質量比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.3 各組大鼠體成分比較與正常組和假手術組比較,模型組大鼠的BMC下降,FAT增加,差異均具有統計學意義(P<0.05),表明去勢可引起大鼠骨礦含量下降,脂肪含量增加。與模型組比較,肌骨寧和雌激素可增加去勢大鼠BMC,降低FAT,差異均具有統計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素均可增加去勢大鼠BMC、降低FAT,調節大鼠體成分變化。見圖2。

注:A:BMC水平比較;B:FAT水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.4 各組大鼠體質量及抓力比較分別在造模前、用藥前和取材前對各組大鼠體質量及前爪抓力進行測量,發現各組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)。造模前,各組大鼠前爪抓力差異無統計學意義(P>0.05);取材前,肌骨寧組和雌激素大鼠組的前爪抓力較模型組有增加趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),表明肌骨寧和雌激素有增加去勢大鼠前爪抓力的趨勢。見圖3。

注:A:各組大鼠體質量的連續性比較;B:各組大鼠取材前體質量比較;C:各組大鼠前爪抓力的連續性比較;D:造模前、取材前各組大鼠前爪抓力比較。

3.5 各組大鼠骨骼肌質量指數和相對骨骼肌質量指數比較與假手術組比較,模型組大鼠SMI和RSMI下降,差異有統計學意義(P<0.05),表明去勢可導致大鼠骨骼肌萎縮。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠SMI和RSMI增加,差異有統計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素防治去勢導致的大鼠骨骼肌萎縮。見圖4。

注:A:各組大鼠四肢感興趣區;B:各組大鼠SMI比較;C:各組大鼠RSMI比較;與假手術組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.6 各組大鼠骨密度比較與正常組和假手術組比較,模型組大鼠全身BMD和股骨BMD下降,差異有統計學意義(P<0.05),表明去勢大鼠發生骨質疏松。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠全身BMD和股骨BMD增加,差異有統計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素均可防治去勢引起的骨質疏松。見圖5。

注:A:全身BMD水平比較;B:股骨BMD水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.7 各組大鼠股骨骨微結構比較與正常組和假手術組比較,模型組大鼠股骨BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N降低,Tb.Sp明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05),表明股骨遠端骨小梁稀疏,體積減小,骨小梁數目和厚度明顯下降,骨小梁分離度明顯增加,股骨遠端發生骨質疏松。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠股骨BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N增加,Tb.Sp下降,差異具有統計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素明顯增加骨小梁體積、數目和厚度,減小骨小梁分離度,防治OP,這與股骨遠端三維重建結果相一致。見圖6—圖7。

注:A:BV/TV水平比較;B:BS/BV水平比較;C:BS/TV水平比較;D:Tb.Th水平比較;E:Tb.Sp水平比較;F:Tb.N水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.8 大鼠血清學檢測與正常組和假手術組比較,模型組大鼠血清骨形成標志物AKP、IGF-1和E2水平下降,骨吸收標志物β-CTx水平增加,差異具有統計學意義(P<0.05),表明去勢可抑制大鼠骨形成,促進骨吸收。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠血清骨形成標志物AKP、IGF-1和E2水平增加,骨吸收標志物β-CTx水平下降,差異具有統計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素抑制去勢大鼠的骨吸收,促進骨形成,防治去勢大鼠的骨質疏松。見圖8。

注:A:AKP水平比較;B:β-CTx水平比較;C:TGF-1水平比較;D:E2水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05;與肌骨寧組比較,dP<0.05。

3.9 各組大鼠腓腸肌和股骨病理染色比較

3.9.1 股骨HE染色與正常組和假手術組比較,模型組大鼠股骨骨小梁數量明顯減少,厚度下降,連續性中斷,分離度增加,骨髓脂肪化嚴重。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠股骨骨小梁數量明顯增加,厚度增加,分離度減小,骨髓脂肪化減輕,表明肌骨寧和雌激素均可防治骨質疏松。見圖9。

圖9 各組大鼠股骨HE染色比較(×200)

3.9.2 腓腸肌HE染色與正常組和假手術組比較,模型組大鼠腓腸肌肌纖維排列紊亂,肌間隙增寬,肌纖維萎縮,肌細胞核皺縮減小。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠腓腸肌肌纖維排列緊密,肌間隙減小,肌纖維增粗,肌細胞核增多增大,表明肌骨寧和雌激素均可防治肌萎縮。見圖10。

圖10 各組大鼠腓腸肌HE染色比較(×200)

4 討論

中醫認為OP屬 “骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇,腎虛是根本,腎精充盛,骨髓充盈,則骨骼強壯有力;脾虛血瘀,運化無力,血瘀氣滯,腎精不足以充養骨髓,則發為本病。“補腎健脾活血”是防治OP及OPF的主要治療原則。中醫認為SP屬 “肉痿”范疇,脾虛肉萎。脾腎虧虛,骨枯肉萎[16-19]。肌骨寧由馬江濤博士領銜研發,從系統藥理學、中藥藥理學、體內外實驗等多方面深入研究,經過反復組方分析,研制而成。全方共五味中藥,包括杜仲、菟絲子、黃芪、丹參和甘草。針對OP“腎虛脾虛血瘀”的病機,方中杜仲、菟絲子補腎壯骨,黃芪補氣健脾,丹參補血活血,甘草調和諸藥,共湊補腎健脾活血、壯骨強肌止痛之功效。組方精簡,效果顯著,已被制成膏方廣泛用于臨床。

去勢模型是研究絕經后OP的“金標準”,去勢引起骨質疏松已經毋庸置疑,然而去勢能否引起肌萎縮目前報道較少。國外學者將5月齡和10月齡的SD大鼠分成假手術組和去勢組并分別配對喂養,發現10月齡的SD大鼠發生骨質疏松和肌肉萎縮[20]。本研究表明,與正常組和假手術組比較,模型組大鼠全身BMD和股骨BMD明顯下降,股骨遠端骨小梁稀疏,數量減小,厚度下降,分離度增加,骨髓脂肪化加重,血清骨形成標志物下降,骨吸收標志物增加,表明OVX大鼠發生骨質疏松。除了骨質疏松,OVX大鼠也明顯發生骨骼肌萎縮。與正常組和假手術組比較,模型組大鼠SMI和RSMI明顯下降,腓腸肌肌纖維排列紊亂,肌纖維間結締組織增生,肌核明顯皺縮,肌肉脂肪化嚴重,表明OVX大鼠發生肌萎縮。可見,去勢不僅引起大鼠骨質疏松,而且引起大鼠肌萎縮。

目前OP治療僅限于“抗骨質疏松”,而忽視了骨質疏松可能伴隨肌萎縮,能否使用中藥同時防治骨質疏松和肌萎縮呢?本研究進一步運用中藥肌骨寧干預OVX大鼠模型,明確肌骨寧對骨質疏松和肌萎縮的防治作用。研究表明,與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠全身BMD和股骨BMD明顯提高,股骨遠端骨小梁數量增加,厚度增加,分離度減小,骨髓脂肪化減輕,血清骨形成標志物增加,骨吸收標志物減少,提示肌骨寧和雌激素可防治去勢大鼠的骨質疏松。除了防治骨質疏松,肌骨寧和雌激素也能防治肌萎縮。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠前爪抓力有增加趨勢,SMI和RSMI明顯增加,腓腸肌肌纖維排列緊密,肌纖維間結締組織減少,肌核明顯增大,肌肉脂肪化減輕,表明肌骨寧和雌激素均可防治肌萎縮。此外,長期使用E2的副作用包括胃部不適、惡心、頭痛、體質量增加和子宮出血,甚至會增加子宮內膜癌的發病率。與E2比較,肌骨寧更便宜,副作用更少。因此,許多患者可能更容易接受肌骨寧。總之,肌骨寧和E2均能有效改善OS大鼠的骨骼和肌肉表型,盡管仍需要大量高質量的隨機對照試驗研究來驗證,但肌骨寧和E2可能是治療OS的潛在藥物。

本研究發現去勢引起大鼠骨質疏松和肌萎縮,肌骨寧和雌激素均能防治骨質疏松和肌萎縮。根據上述研究,結合國內外報道[7,21-23],認為骨質疏松和肌萎縮之間存在生理病理上的聯系,兩者可能有共同的調控機制。肌肉和骨骼位置毗鄰,肌肉為骨骼運動提供動力來源,骨骼為肌肉生長提供物理支撐;肌肉除牽拉刺激骨細胞生長外,還可作為內分泌器官分泌骨因子,促進骨細胞生長;骨骼也可作為內分泌器官分泌骨因子,刺激肌細胞增長。肌肉和骨骼在生物力學穩態、內分泌穩態、基因作用等方面存在復雜深入的關系,因此研究者稱其為“肌骨串擾”[24-26]。有研究認為,GH/IGF-1/PI3K/Akt信號通路與兩者的發病密切相關[7],其中雌激素、睪酮、生長激素和IGF-1可能起到重要作用。骨質疏松和肌萎縮患者中較低的維生素D水平可能與兩者的發病相關[27]。研究認為,骨骼肌Akt1/2基因缺失導致小鼠OS發病,并引起小鼠壽命縮短[28]。有研究認為,骨質疏松和肌萎縮兩者經常同時存在[9,29-31],稱之為OS,OS患者跌倒、骨折、住院、殘疾和死亡風險遠高于僅患骨質疏松或肌少癥者,并且發病機制復雜。本研究也證實,合成代謝類激素IGF-1和E2在OVX大鼠模型中含量明顯變低,藥物干預后明顯增加,合成代謝類激素可能和OS的生理病理相關。

無論是骨質疏松,還是肌萎縮,甚至是肌少—骨質疏松癥,單單“從骨論治”已經明顯不妥,“肌骨同治”才是最佳選擇。肌骨寧基于OP“腎虛脾虛血瘀”病機,“肌骨同治”,強肌壯骨,為骨質疏松合并肌萎縮患者提供了中醫方案。