基于網絡藥理學和分子對接探討四物湯治療復發性流產的作用機制*

郭利,任夢雪,侯梓桐,陳紫薇,周琳,陳瑞雪

中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053

復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指與同一性伴侶發生兩次及以上孕24周內的妊娠丟失[1],困擾著1%～5%的育齡期女性[2]。RSA與多種因素相關,但臨床上仍約50%的患者病因不明[3],臨床診療棘手,是目前生殖醫學亟待解決的熱點難題之一。研究表明,既往多次流產史是產科并發癥的高危因素,RSA患者具有更高罹患心血管疾病、靜脈血栓栓塞性疾病的風險,甚至與過早死亡存在相關性[4-5],因此防治RSA具有重要的臨床和社會意義。中醫學將RSA歸屬于“滑胎”“數墮胎”“屢孕屢墮”等范疇,認為母體沖任損傷、胎元不固是其主要病機,臨床多從腎虛、脾腎虛弱、氣血兩虛、血熱和血瘀等角度論治[6]。基于“治未病”和“預培其損”理念,中醫藥通過孕前干預在提高RSA患者再次妊娠率和保胎成功率方面具有顯著而獨特的優勢。四物湯出自《仙授理傷續斷秘方》,由熟地黃、當歸、白芍、川芎組成,功專補血養血活血,為婦科調經、種子的基礎方,被譽為“補血第一方”“婦科第一方”。導師陳瑞雪教授長期從事RSA相關臨床研究,常以氣血立論,擅長以四物湯為基礎方加減防治RSA,臨床療效顯著[7],但其作用機制尚不明確,臨床推廣應用較為局限。本文通過網絡藥理學和分子對接探討四物湯治療RSA的活性成分、核心靶點及信號通路,初步揭示其內在機理,為進一步實驗研究指明方向。

1 資料與方法

1.1 搜集四物湯活性成分及作用靶點在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索熟地黃、當歸、白芍、川芎的化學成分,并設置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性指數(drug-likeness,DL)≥0.18,搜集有效活性成分及作用靶點,再通過Cytoscape3.9.0繪制四物湯“活性成分-作用靶點”網絡圖。

1.2 篩選RSA相關靶點及四物湯治療RSA的潛在靶點在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org)和Genecards(https://www.genecards.org)數據庫中檢索“recurrent spontaneous abortion” “RSA”等關鍵詞獲取疾病靶點,其中Genecards數據庫靶點篩選條件為Score值大于中位數,將兩個數據庫檢索結果合并去重得到RSA相關靶點。將RSA相關靶點與四物湯活性成分相關靶點導入Venn Diagram,獲得四物湯與RSA的共同靶點,即為四物湯治療RSA的潛在靶點。

1.3 構建PPI網絡在STRING數據庫(https://string-db.org)中設定“Homo Sapiens”“medium confidence>0.4”,構建共同靶點的PPI網絡,再通過CytoScape3.9.0可視化展示并篩選核心靶點。

1.4 富集分析將共同靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,通過微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)以氣泡圖形式展示結果。

1.5 分子對接通過PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取主要活性成分的3D結構式,并運用Open Babel軟件將其轉化為mol2格式。在PDB數據庫(https://www.rcsb.org)下載關鍵靶點蛋白結構式,并運用Pymol、AutoDock Tools1.5.7軟件處理蛋白,最后使用AutoDock4進行分子對接,Pymol軟件將對接結果可視化。

2 結果

2.1 四物湯活性成分及作用靶點基于TCMSP獲得四物湯活性成分24個,對應242個作用靶點,合并去重后活性成分共20個,作用靶點103個,見表1。將結果導入Cytoscape3.9.0軟件,繪制四物湯“活性成分-作用靶點”網絡圖,見圖1,該網絡由121個節點和260條邊組成。根據Network Analyzer計算Degree值,排名前6位的活性成分為β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、楊梅素、谷甾醇、(+)-兒茶素,見表2。

注:圓形為藥材;六邊形為活性成分,其中A1、B1、C1為共有成分;菱形為作用靶點;SDH:熟地黃;DG:當歸;BS:白芍;CX:川芎。

表1 四物湯組方中藥活性成分及作用靶點數目

表2 四物湯排名前6位的活性成分

2.2 RSA相關靶點從Genecards數據庫檢索出 2 481 個RSA靶點,其中Score值中位數為3.01,故篩選分值大于3.01的靶點與OMIM數據庫篩選的靶點合并去重,最終獲取1539個RSA相關靶點。通過Venn Diagram共獲得64個共同靶點,見圖2。

圖2 四物湯與RSA靶點韋恩圖

2.3 共同靶點PPI網絡將 64個共同靶點導入STRING數據庫獲取PPI信息,再運用CytoScape 3.9.0進行可視化,見圖3,圖中的64個節點代表蛋白質,516條邊代表蛋白質之間的相互作用關系。根據Network Analyzer共獲得12個核心靶點,以柱狀圖可視化展示,見圖4。

圖3 共同靶點PPI網絡圖

圖4 PPI核心靶點

2.4 GO和KEGG富集分析運用DAVID數據庫進行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析共獲得283個生物過程(biological processes,BP)、32個細胞組分(cellular components,CC)及74個分子功能(molecular functions,MF)。其中BP主要涉及調節細胞對多種化合物的應答,如雌二醇(response to estradiol)、脂多糖(response to lipopolysaccharide)、腫瘤壞死因子(response to tumor necrosis factor)等,調控平滑肌細胞的增殖(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)及血管生成(angiogenesis)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜腔(caveola)、細胞外間隙(extracellular space)等;MF在酶結合(enzyme binding)、蛋白質結合(protein binding)、類固醇結合(steroid binding)等方面較為顯著。KEGG富集分析共獲得88條信號通路,主要涉及癌癥(pathways in cancer)、乙型肝炎(hepatitis B)、結核(tuberculosis)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路等,而血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、細胞凋亡(apoptosis)、缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)、Toll樣受體(Toll-like receptor)等信號通路也表現出較高的顯著性。最后通過微生信平臺將結果可視化處理,見圖5—圖8。

圖5 GO功能富集分析(BP)

圖6 GO功能富集分析(CC)

圖7 GO功能富集分析(MF)

圖8 KEGG信號通路富集分析

2.5 分子對接通過VLOOKUP函數將四物湯活性成分及作用靶點與共同靶點相對應,以獲取四物湯關鍵活性成分,排名前4位的活性成分為山柰酚、β-谷甾醇、楊梅素、豆甾醇。將PPI核心靶點中排名前6位的靶點蛋白白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)(1ALU)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(7JRA)、蛋白激酶1(protein kinase1,AKT1)(4GV1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)(1GWQ)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)(5IBP)、前列腺素內過氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)(5KIR)分別與4個關鍵活性成分進行分子對接,以考察四物湯治療RSA的活性成分與關鍵靶點之間的結合模式及結合能力強弱。分子對接顯示,除CASP3與山柰酚外,活性成分與關鍵靶點之間的結合能均<-5 kcal·mol-1,表明兩者結合活性較好[8],見表3。其中,TNF與 β-谷甾醇、PTGS2與豆甾醇的結合活性尤為突出,IL-6與山柰酚形成氫鍵最多,用Pymol軟件將其對接結果可視化,見圖9。

圖9 四物湯活性成分與部分關鍵靶點對接模式圖

表3 分子對接結合能 (kcal·mol-1)

3 討論

《景岳全書·婦人規》云:“婦人所重者在血,血能構精,胎孕乃成”[9],《傅青主女科》載:“精滿則子宮易于攝精,血足則子宮易于容物”[10],皆強調精血充足是正常妊娠的必要條件。婦人以血為本,精血同源,RSA患者屢孕屢墮往往耗傷腎精而致陰血不足。加之患者多伴焦慮、抑郁情緒,肝失疏泄,日久化火而暗耗陰血,陰血愈加不足,因此補血養血是治療RSA的重要思路。四物湯是補血養血兼活血行血的經典方劑,方中熟地黃大補肝腎精血;當歸養血調經,還可補血活血,為婦科調經要藥;白芍酸斂,可柔肝養肝,充養女子之先天;川芎活血祛瘀,行氣止痛,為血中氣藥。諸藥合用,使補血而不滋膩,行氣而不傷血,臨床以四物湯組方治療婦科類疾病療效顯著。清代醫家汪昂云:“凡血證,通宜四物湯”[11]。

為探究四物湯治療RSA的潛在作用機制,本文運用網絡藥理學技術共獲取四物湯活性成分20個,治療RSA的靶點64個,并篩選出β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、楊梅素等關鍵活性成分,表明四物湯可能是通過這些活性成分對RSA發揮治療作用。β-谷甾醇可通過下調Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IL-1受體關聯激酶1(IL-1 receptor associated kinase 1,IRAK1)的表達,抑制炎癥信號通路關鍵分子的活化,減少分泌IL-6、TNF-α等炎性因子,起到抗炎作用[12]。山柰酚作為黃酮類化合物,其作用涉及抗炎、抗氧化、保護損傷組織等[13]。豆甾醇具有較強的抗氧化作用,還可能通過調控雌激素信號通路上絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等表達,減少炎癥反應[14]。楊梅素具有抗氧化、抑制炎癥因子等作用,還可拮抗血小板活化因子,從而改善微循環,保護血管[15]。

通過PPI網絡可以發現IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2等是四物湯治療RSA的核心靶點,表明四物湯可能通過這些蛋白質保護妊娠。IL-6主要參與調節胚胎發育和妊娠過程中母胎界面免疫耐受功能[16],過低的IL-6不利于胎盤血管生成可致流產[17]。TNF可通過促進滋養細胞凋亡、興奮子宮平滑肌收縮、激活機體凝血系統、激發母體與胚胎組織免疫排斥等導致流產發生[18]。研究表明,RSA患者血清組織呈現IL-6減少、TNF-α升高的特點[19]。AKT1主要參與血管生成、血管擴張和血管重構過程,可通過調節磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/AKT1信號通路促進母胎界面血管生成,降低流產率[20]。ESR1基因突變可通過改變血清雌激素水平影響妊娠,可能是URSA發病機制之一[21]。CASP3可通過促進滋養層細胞中的細胞凋亡導致RSA發生和發展[22]。PTGS2負責誘導產生前列腺素,而前列腺素可通過多種細胞過程促進母體免疫耐受,影響妊娠進程[23]。

對核心靶點進行GO功能富集分析發現,四物湯主要通過調節細胞應答、基因轉錄,調控平滑肌細胞的增殖及血管生成等生物過程對RSA發揮治療作用。KEGG信號通路分析顯示核心靶點參與的通路主要涉及RSA發病機制中的TNF、VEGF、HIF-1、Toll樣受體等信號通路。VEGF可促進微血管通透性和血管生成,其表達下調與RSA關系密切[24]。HIF-1α能調節多種基因的表達,與血管形成、細胞凋亡等多種生物學效應相關,參與子宮內膜蛻膜化過程的調節,維持正常妊娠[25]。動物研究顯示,RSA模型小鼠中HIF-1αmRNA及蛋白表達水平均下降[26]。Toll受體主要表達于免疫細胞,參與機體免疫反應,其異常表達可誘發母胎界面免疫排斥反應,導致反復妊娠丟失。研究發現,RSA患者蛻膜和血清組織中均存在TLR4高表達[27]。分子對接結果表明,四物湯關鍵活性成分山柰酚、β-谷甾醇、楊梅素、豆甾醇與核心靶點IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2的結合活性基本良好,在分子層面進一步驗證了四物湯治療RSA的潛在作用機制。

本研究結果提示,四物湯可能通過山柰酚、β-谷甾醇、楊梅素、豆甾醇等活性成分與IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2等核心靶點發生相互作用,通過調控TNF、VEGF、HIF-1、Toll樣受體等多種信號通路,調節細胞凋亡與炎癥反應、改善母胎界面免疫微環境以及促進血管生成,從而改善不良妊娠結局,提高妊娠成功率。但本研究結果是以分子大數據為基礎的分子機制的探討,今后尚需通過設計嚴謹的實驗驗證,以提高結論的科學性和準確性。