透明質(zhì)酸的抑菌性能及在干酪制品中的應(yīng)用

柴云雷 郭 麗 張雅娜 郭 齊

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院 黑龍江綏化 152061）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種大分子線性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基氨基-D-葡萄糖二糖單位交替連接組成，它廣泛存在于高等動物的各種組織中，不同組織中含量不同，其中眼玻璃體、皮膚、臍帶和關(guān)節(jié)滑液中含量較高[1]。HA為大分子物質(zhì)，其相對分子量（relative molecular mass，Mr）大約為5～20000 kDa，因其分子中含有大量羥基和羧基，所以具有極強(qiáng)的保水作用[2]。此外HA還具有良好的抗炎促修復(fù)、調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移等作用。不同生物體，不同組織來源的HA其分子量大小不同，發(fā)揮作用也不同[3]。研究表明，高M(jìn)r的HA能夠刺激抗炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞增殖、分化和遷移，抑制血管和顆粒組織生成。反之，低Mr 的HA 會增強(qiáng)促炎癥基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成[4-6]。目前關(guān)于HA的研究還主要集中在醫(yī)學(xué)和化妝品方面，而其它方面的性能還有待進(jìn)一步研究。

干酪（又稱奶酪）是指在乳中（也可以是脫脂乳或稀奶油）中加入適量發(fā)酵劑和凝乳酶使乳蛋白質(zhì)凝固，排除乳清后，將凝塊壓成所需性狀而制成的產(chǎn)品[7]。干酪可以說是純奶的濃縮，因而含有的營養(yǎng)物質(zhì)更加豐富，極易被微生物污染發(fā)生變質(zhì)，所以一般通過添加食品防腐劑來延長食品保質(zhì)期。考慮到化學(xué)合成類添加劑的安全隱患，近年來研究者更多將目光投向天然提取類物質(zhì)，如，在奶酪制品中添加納他霉素。有報(bào)道稱HA具有抑菌性[8]，但其抑菌性的研究主要集中在與其他物質(zhì)的結(jié)合方面，如，Jayesh 等[9]在將HA 與頭孢西丁鈉復(fù)合研究抑菌性，Sara 等[10]在將HA 與殼聚糖復(fù)合研究其抑菌功效等。而單獨(dú)研究HA抑菌性的幾乎沒有，再結(jié)合HA的性能與相對分子量和濃度相關(guān)這一特點(diǎn)，因此，本文將不同Mr 不同濃度的HA 進(jìn)行抑菌性能的比較研究，并將HA應(yīng)用于干酪制品中測定其抑菌效果，該研究對進(jìn)一步了解、開發(fā)和應(yīng)用透明質(zhì)酸提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)為天然型防腐劑的選擇打開新思路。

一、材料和方法

（一）材料和試劑。高M(jìn)r（1800-2200 kDa）、中Mr（1300-1500 kDa、800-1000 kDa）和低Mr（200-400 kDa）的透明質(zhì)酸粉末[11]：山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和志賀氏菌（Shigella）：綏化市食品藥品檢驗(yàn)檢測所；啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：百威英博哈爾濱啤酒有限公司；馬鈴薯、妙可藍(lán)多馬蘇里拉干酪（原制干酪）、妙可藍(lán)多奶酪棒（再制干酪）：市售。

牛肉膏：北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、氯化鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純。

（二）儀器和設(shè)備。XFH-30L高壓蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海-恒科學(xué)儀器有限公司；XH-C旋渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠：752紫外-可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

（三）透明質(zhì)酸抑菌性能的比較。

1.透明質(zhì)酸抑菌作用的測定。

（1）培養(yǎng)基的配制。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮切成小塊，稱取200 g放入鍋中，加1000 mL蒸餾水，在電爐上加熱至沸騰，維持25 min后，趁熱用2層紗布過濾，棄去濾渣，在濾液中加入20 g葡萄糖溶解后，加蒸餾水補(bǔ)至1000 mL，固體培養(yǎng)基另加20 g瓊脂粉，pH自然，放入高壓蒸汽滅菌鍋，121℃滅菌15 min，用于培養(yǎng)啤酒酵母。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加入蒸餾水溶解定容至1000 mL，固體培養(yǎng)基另加20 g瓊脂粉，調(diào)pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，用于培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌。

（2）菌種純化及菌懸液的制備。從-80℃冰箱中取出各菌種放在4℃冰箱中備用，在無菌操作環(huán)境下，用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌種，在固體平板培養(yǎng)基上劃線，倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，啤酒酵母劃線在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h。然后分別挑取單菌落接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌37℃培養(yǎng)18 h，啤酒酵母28℃培養(yǎng)24 h。最后用接種環(huán)蘸取菌液劃線于相應(yīng)的試管斜面，培養(yǎng)后放入4℃冰箱備用。

使用前，在無菌條件下挑取一環(huán)接種于5 mL無菌生理鹽水中，渦旋混勻后制成菌懸液。

（3）濾紙片法測定透明質(zhì)酸的抑菌作用。稱取不同質(zhì)量（0.015 g、0.010 g、0.005 g）HA粉末溶解于10 mL無菌水中，放置在4℃冰箱中溶解分別制備成濃度為15 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL的溶液。吸取100 μL的菌懸液接種到相應(yīng)固態(tài)培養(yǎng)基中，用涂布棒涂布均勻。將濾紙用打孔器制成直徑6 mm的濾紙片若干，放入培養(yǎng)皿中高壓滅菌，干燥器中干燥后，分別放入不同濃度的HA 溶液中浸泡20 min，瀝干后用鑷子均勻鋪在培養(yǎng)基上[12]。每個(gè)培養(yǎng)基中放入5 個(gè)濾紙片。其中1、2、3 號用同一HA溶液浸泡作為平行試驗(yàn)，4號用75%乙醇浸泡為陽性對照，5號用無菌水浸泡為陰性對照。處理好的培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中，細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24 h，真菌在28℃培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑（mm），結(jié)果取平均值。

2.透明質(zhì)酸最小抑菌濃度的測定。采用試管二倍稀釋法將不同Mr 的HA 分別配制成濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009 mg/mL 的溶液，依次取5 mL各濃度HA溶液于11支無菌試管中，再各加入0.5 mL菌懸液和5 mL 對應(yīng)的無菌液體培養(yǎng)基[13]。0 號陰性對照管中加入5.5 mL無菌水和5 mL對應(yīng)的液體培養(yǎng)基，12號陽性對照管中加入5 mL無菌水、5 mL對應(yīng)的液體培養(yǎng)基和0.5 mL菌懸液。

將處理后的樣品分別放入各菌種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24～36 h。結(jié)束后觀察試管渾濁情況并在600 nm波長下測定此時(shí)溶液的吸光度值。若液體澄清且吸光度值接近陰性對照，此時(shí)對應(yīng)的HA溶液最小濃度即為MIC值。

（四）透明質(zhì)酸在干酪制品中的抑菌作用。取700 g干酪制品，均分成14份且形狀為見方形，標(biāo)號為1～14號。其中1～7號樣品作為對照組不添加HA。8～14號樣品作為試驗(yàn)組，均在干酪制品表面涂抹1.5 mL高M(jìn)r、濃度為10 mg/mL的HA溶液。將制備好的樣品用滅菌的玻璃廣口瓶密封包裝，室溫存放。然后分別在放置的第1、2、3、4、5、6、7 d從對照組和試驗(yàn)組中各取1個(gè)樣品進(jìn)行菌落總數(shù)的測定，測定方法依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2016中的平板計(jì)數(shù)法[14]。

（五）數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Means±SD）”，采用OriginPro 8.5.1 軟件進(jìn)行繪圖，SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVA 分析和Tukey 多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。

二、結(jié)果與分析

（一）透明質(zhì)酸抑菌作用的試驗(yàn)結(jié)果。中Mr（1300-1500 kDa）、濃度為15 mg/mL的HA溶液，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的抑菌效果見圖1。

圖1 中相對分子量HA對不同菌種抑菌圈效果圖

為直觀清晰比較不同Mr、不同濃度的HA溶液對四種供試菌的抑菌作用，將抑菌結(jié)果制成表1～表4。

表1 高M(jìn)r（1800-2200kDa）透明質(zhì)酸抑菌試驗(yàn)結(jié)果比較

表2 中Mr（1300-1500 kDa）透明質(zhì)酸抑菌試驗(yàn)結(jié)果比較

表3 中Mr（800-1000 kDa）透明質(zhì)酸抑菌試驗(yàn)結(jié)果比較

表4 低Mr（200-400 kDa）透明質(zhì)酸抑菌試驗(yàn)結(jié)果比較

由表1可知，對照組無菌水抑菌圈直徑為6mm，且對不同菌株之間無顯著性差異，說明試驗(yàn)結(jié)果有效可行。高M(jìn)r（1800-2200 kDa）的HA不同濃度的抑菌圈直徑均大于6 mm，說明HA具有抑菌性。這與鐘良軍發(fā)現(xiàn)結(jié)果相符，陳菲等[15]在研究HA與鹽酸米諾環(huán)素聯(lián)合抑菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)HA也具有抑菌作用，這也與本研究結(jié)果一致。抑菌圈直徑在不同濃度和不同菌種之間的ANOVA 分析中均有顯著性差異，說明其抑菌效果與之相關(guān)。同一菌種不同濃度的HA 其抑菌性表現(xiàn)為：10%＞5%＞15%，且抑菌性均大于75%乙醇。HA隨分子量增大，分子體積也增大，因其強(qiáng)大的吸水性，使體積增大速率會更快，是分子量增大的1.8倍，使溶液粘度增加，而有限的空間HA鏈擁擠在一起，使其不利于與微生物接觸并起到抑制作用[16]。同樣溶液濃度增大也會使溶液粘度增大，大分子聚集，不利于抑制微生物生長。所以高M(jìn)r 的HA 在高濃度時(shí)抑菌性降低。而在低濃度時(shí)，雖然HA分子量較大，但仍可以單體狀態(tài)存在，與微生物較好的接觸并抑制其生長。同一濃度HA對不同菌種的抑菌性表現(xiàn)為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌，Ardizzoni等[17]在研究HA抑菌能力時(shí)，證明了HA對不同微生物菌屬有不同的抑菌能力，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。但由于試驗(yàn)菌種較少，不能判斷HA的抑菌規(guī)律，可通過后續(xù)擴(kuò)大菌種范圍進(jìn)一步研究。

由表2和表3可知，中Mr的HA具有抑菌性，且抑菌性仍大于75%乙醇。同一菌種不同濃度HA 的抑菌性表現(xiàn)為：15%＞10%＞5%，因?yàn)镠A分子量下降，體積減少，溶液粘度降低使其能在溶液中較好的分散，即使在較高濃度下仍能以單體狀態(tài)存在并發(fā)揮抑菌作用。但中Mr（1300-1500 kDa）的HA（15%濃度）其抑菌性略低于高M(jìn)r的HA（10%濃度），可在后續(xù)將中Mr的HA溶液濃度提高做進(jìn)一步研究。綜合表1，表2，表3可知，HA 隨Mr 下降其抑菌性能降低。在差異性比較中也發(fā)現(xiàn)，HA隨Mr下降，不同濃度間抑菌圈直徑的差異性降低，且與75%乙醇的抑菌性差距縮小。同一濃度HA溶液對不同菌種的抑菌性仍表現(xiàn)為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌。

由表4可知，低Mr的HA同樣具有抑菌性，但這與沙坤等認(rèn)為的HA 的低Mr 與高M(jìn)r 在性能方面相反的這一說法不同，原因是目前對于低Mr的HA定義還很模糊，在不同研究中HA分子量從少量雙糖到700 kDa均有用“短片段HA”、“低分子量”和“HA 寡糖”來進(jìn)行描述，因此對于低Mr 的HA 在性能上會存在差異。但由表4可知，低Mr的HA抑菌性能明顯降低，這與之前分析的分子量下降抑菌性能降低結(jié)果一致。不同濃度的HA其抑菌性同樣表現(xiàn)為：15%＞10%＞5%，且10%的抑菌性能與75%乙醇相近，5%的抑菌性能低于75%乙醇。HA對不同菌種的抑菌性表現(xiàn)為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌。

（二）透明質(zhì)酸MIC測定試驗(yàn)結(jié)果。不同Mr的HA對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的MIC 結(jié)果見表5～表8。

表5 高M(jìn)r（1800-2200 kDa）MIC測定結(jié)果

表6 中Mr（1300-1500 kDa）MIC測定結(jié)果

表7 中Mr（800-1000 kDa）MIC測定結(jié)果

表8 低Mr（200-400 kDa）MIC測定結(jié)果

由表5 可知，高M(jìn)r 的HA 在0.009～0.039 mg/mL 的濃度范圍，對四種供試菌均無抑制性。HA對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的MIC 值依次為：0.312、1.25、2.5 和2.5 mg/mL，再結(jié)合不同濃度下菌種的生長情況可知對四種菌的抑菌情況為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌，與抑菌圈測定結(jié)果一致。

由表6可知，HA在0.009～0.078 mg/mL的濃度范圍，對四種供試菌均無抑制性，MIC 值依次為：1.25、2.5、2.5 和2.5 mg/mL。由表7可知，HA在0.009～0.156 mg/mL的濃度范圍，對四種供試菌均無抑制性，MIC值依次為：2.5、2.5、2.5和5 mg/mL，這些數(shù)據(jù)都進(jìn)一步說明隨Mr 降低HA 的抑菌性呈下降趨勢。同樣與抑菌圈測定結(jié)果相符。

由表8可知，低Mr的HA在0.009～0.156 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，對四種供試菌無抑制性，但濃度在0.312 mg/mL時(shí)其抑菌性低于中Mr的HA，其MIC值僅對大腸桿菌達(dá)到2.5 mg/mL，對其余三種菌株均為5 mg/mL，結(jié)合表4結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA濃度為5 mg/mL時(shí)抑菌圈直徑大小都為6 mm附近，說明雖然有抑菌效果，但抑菌效果很小，前后結(jié)果相符。

（三）透明質(zhì)酸在干酪制品中的抑菌作用。經(jīng)上述研究發(fā)現(xiàn)，高M(jìn)r的HA在10 mg/mL時(shí)抑菌作用最強(qiáng)，將其應(yīng)用于原制干酪和再制干酪兩款產(chǎn)品，測定樣品存放期間菌落總數(shù)的變化，結(jié)果見表9和圖2。

表9 不同干酪制品在存放期間菌落總數(shù)的變化

由圖2可知，干酪制品在存放期間其菌落總數(shù)隨時(shí)間延長呈上升趨勢。相比于干酪制品對照組，試驗(yàn)組在添加HA后明顯抑制了樣品中菌落總數(shù)的生長。對照組樣品在第7天菌落總數(shù)達(dá)到105 cfu/mL，而試驗(yàn)組的菌落總數(shù)為104 cfu/mL。對照組在前3天菌落總數(shù)增加較為緩慢，這是因?yàn)樵诟衫抑破分斜旧泶嬖谑称贩栏瘎?，其中原制干酪中添加了山梨酸鉀和納他霉素，再制干酪僅添加山梨酸鉀，因?yàn)樵聘衫覡I養(yǎng)較再制干酪更為豐富，所以更易變質(zhì)。試驗(yàn)組中因?yàn)樘砑親A，使樣品的菌落總數(shù)在第4天之后開始快速增長，延長了微生物生長的遲緩期，這與食品防腐劑作用相同。之后對照組和試驗(yàn)組中菌落總數(shù)均開始快速增長，是因?yàn)槭称贩栏瘎﹥H能起到抑制微生物生長，延長遲緩期的作用，而當(dāng)樣品中微生物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，即使添加再多防腐劑也無用。在第6天之后，樣品中的菌落總數(shù)增長速率有所下降，是因?yàn)槭称分袪I養(yǎng)物質(zhì)的下降，以及微生物間的競爭作用。

三、結(jié)語

本研究通過比較高M(jìn)r（1800-2200 kDa）、中Mr（1300-1500 kDa、800-1000 kDa）、低Mr（200-400 kDa）四種HA 在不同濃度（15 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL）時(shí)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)不同Mr、不同濃度的HA 對四種供試菌均具有抑菌性，且抑菌性能隨HA 的Mr 降低而呈下降趨勢。高M(jìn)r 的HA 在中濃度（10 mg/mL）時(shí)抑菌性能最高，中Mr 和低Mr 的HA 在高濃度（15 mg/mL）時(shí)抑菌性能較高。HA 對四種供試菌的抑制程度依次為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌。將HA應(yīng)用于干酪制品，發(fā)現(xiàn)樣品在存放期間菌落總數(shù)的增長得到明顯抑制，具有食品防腐劑功效，該研究為HA的應(yīng)用開發(fā)奠定了一定理論基礎(chǔ)。