非小細胞肺癌中可變剪切基因及其作用的研究進展

王瑩，張明暉

赤峰市醫院腫瘤內三科，內蒙古赤峰024000

肺癌是嚴重威脅我國居民健康的主要公共衛生問題之一。據統計，2020年我國肺癌新發病例約82萬例、死亡病例約72萬例，其發病率和死亡率均居我國惡性腫瘤首位。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的組織學類型，占所有肺癌的80%～85%，根據病理學類型可分為腺癌、鱗癌、大細胞癌三個亞型［1］。NSCLC早期癥狀不典型，大多數患者發現時已是中晚期，5年生存率較低［2］。但目前NSCLC的發病機制仍不完全清楚。可變剪切是指一個mRNA前體通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產生不同mRNA剪接異構體的過程，主要包括可變啟動子（AP）、可變終止子（AT）、外顯子跳躍（ES）、可變供體位點（AD）、可變受體位點（AA）、內含子保留（RI）和外顯子互斥（ME）七種可變剪切事件［3］。可變剪切是調節基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制，也是真核生物轉錄組復雜性和多樣性的重要原因。以往研究報道，可變剪切基因異常幾乎與腫瘤細胞的所有特征表型有關，能夠參與包括NSCLC在內的多種腫瘤的發生、發展以及治療耐藥［4］。本文結合文獻就可變剪切基因在NSCLC中作用的研究進展作一綜述。

1.變剪切基因概述

可變剪切是指一個mRNA前體通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產生不同mRNA剪接異構體的過程。mRNA從前體到成熟需要去除內含子及連接外顯子，其中順式作用元件與反式作用因子相互作用，影響剪切位點，使得某些mRNA改變了原始閱讀框架，導致一個基因產生多種不同的異構體，從而編碼不同結構或功能的蛋白質［5］。前體mRNA的可變剪切過程是多細胞生物中基因表達調控的普遍模式之一，涉及多序列基序與同源蛋白質的相互作用，其錯誤調節能夠影響細胞的增殖、凋亡以及血管生成和能量代謝等。可變剪切基因活性改變是惡性腫瘤中可變剪切失調的重要原因之一，特定基因的剪切變體可直接介導惡性腫瘤的發生、發展，如BRCA1、p53等［6］。

可變剪切能夠使一個基因產生多個mRNA，最終產生不同的蛋白質。腫瘤細胞在可變剪切過程中具有腫瘤類型特異性及亞型特異性。有學者對包括肺癌在內的32種不同腫瘤可變剪切基因分析發現，絕大多數可變剪切基因只存在于腫瘤組織中［7］。一項生存分析發現，可變剪切事件與肺腺癌或肺鱗癌患者的總生存期顯著相關［8］。LIU等［9］研究報道，肺腺癌預后相關的可變剪切事件與免疫細胞浸潤程度、腫瘤突變負荷、免疫檢查點表達水平以及免疫應答高度一致。以上研究表明，可變剪切在NSCLC的發生、發展中起著至關重要的作用。

2.SCLC中的可變剪切基因及其作用

目前，全基因組研究已公布了27種人類惡性腫瘤中超過15 000個可變剪切基因。在肺癌中的可變剪切基因主要包括B淋巴細胞瘤xL（Bcl-xL）、甘氨酸脫羧酶（GLDC）、RNA結合蛋白（RBM）、富絲氨酸/精氨酸的剪接因子（SRSF）、內收蛋白3（ADD3）及酪氨酸激酶受體（MET）等，這些可變剪切基因能夠參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物學行為［10］。本文重點介紹其中六種具有潛在臨床價值的可變剪切基因及其變體。

2.1.ET MET是一種原癌基因，定位于人染色體7q21-31，長度約125 kb，含有21個外顯子。MET的主要突變類型包括14外顯子跳躍突變、基因擴增、激酶域突變以及基因融合等［11］。其中，MET 14外顯子跳躍突變是近年來備受關注的突變類型。研究報道，MET 14外顯子跳躍突變可使含有E3泛素連接酶c-Cbl的近膜端結構域缺失，MET蛋白泛素化降低，致使MET蛋白不斷積累，從而使MET信號通路持續激活，繼而導致腫瘤發生。MET的編碼蛋白具有酪氨酸激酶活性，是一種肝細胞生長因子（HGF）酪氨酸激酶受體，被配體激活后可導致其下游信號通路的激活，如Ras/ERK/MAPK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和STAT等信號通路，進而導致腫瘤細胞增殖、侵襲以及腫瘤血管生成［12］。在NSCLC患者中，MET 14外顯子跳躍突變的發生概率為1%～3%，多見于老年NSCLC患者，一般不與EGFR、ALK、ROS1等致病基因同時存在，但常與TP53突變、CDKN2A/B缺失以及MET、MDM2或CDK4/6擴增共存。研究表明，MET 14外顯子跳躍突變的NSCLC可對MET酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）產生應答，建議晚期NSCLC患者在二代基因測序中納入MET 14外顯子跳躍突變這一生物標志物［13］。目前，靶向MET或HGF的藥物主要分為小分子TKIs和單克隆抗體。小分子TKIs又進一步細分為多激酶MET抑制劑和選擇性MET抑制劑。多激酶MET抑制劑包括克唑替尼、卡博替尼、格列替尼、AMG208、奧曲替尼和戈伐替尼。選擇性MET抑制劑包括ATP競爭性藥物卡馬替尼、特泊替尼以及非ATP競爭性藥物替萬替尼。單克隆抗體分為抗MET抗體奧那妥組單抗、依瑪妥珠單抗與抗HGF抗體非拉妥組單抗、利妥木單抗。這些靶向藥物在NSCLC治療中具有非常廣闊的應用前景［14］。

2.2.LDC GLDC是一種與細胞代謝有關的致癌基因，定位于人染色體9p24.1。由人類GLDC編碼的P蛋白是甘氨酸裂解系統的關鍵酶，能夠分解代謝甘氨酸生成5，10-亞甲基四氫葉酸，從而參與細胞甘氨酸代謝。GLDCV1是GLDC的可變剪切異構體，其外顯子1的3'端49～448位點缺失400 bp。與GLDC全長cDNA產物相比，GLDCV1在194位點丟失了原始ATG序列。GLDC全長cDNA產物GLDCf1及其剪切變體GLDCV1過表達可促進正常肺成纖維細胞p-ERK、p-p38、Cyclin D1表達，從而發揮促癌作用［15］。GLDC可通過外顯子跳躍方式來空間位阻反義寡核苷酸shAON，抑制NSCLC細胞GLDC過表達。在GLDC-shAON的腫瘤組織中，丙酮酸向乳酸的轉化水平顯著降低，丙酮酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性降低，細胞外酸化速率明顯受到抑制，順鉑的治療效果也隨之增強。這表明GLDC-shAON或可與常規化療藥物聯合應用，從而增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［16］。在預后方面，GLDC過表達NSCLC患者的死亡風險是其低表達NSCLC患者的4倍。在與甘氨酸代謝有關的腫瘤中，應用高毒性抗葉酸藥物甲氨蝶呤可能有效。聯合應用抗葉酸藥物與GLDC表達抑制劑或尋找甘氨酸裂解復合物特異性抗葉酸藥物，類似于在靶向治療中尋找激酶特異性抑制劑，或可成為更有效的靶向治療策略［17］。

2.3.BM RBM是一類RNA結合蛋白，包含RNA識別基序、RNA結合結構域和核糖核蛋白基序，可參與RNA代謝，包括剪切、轉運、翻譯及其穩定性。研究發現，RBM結合蛋白家族成員RBM異常表達和功能失調與腫瘤的發生、發展密切相關。目前，已知的RBM超過50種。本文著重介紹具有潛在臨床應用價值的RBM5和RBM10。

2.3.1.BM5 RBM5定位于人染色體3p21.3，是近年新發現的一種抑癌基因。在超過90%小細胞肺癌（SCLC）和50%～80% NSCLC患者中可檢測到RBM5缺失。RBM5的前體mRNA發生可變剪切后產生至少三種蛋白質編碼變體，至少一種反義非編碼RNA在RBM5內發生轉錄，激活線粒體細胞相關凋亡途徑，包括胱天蛋白酶2和細胞表面死亡受體Fas，從而調節細胞凋亡。RBM5蛋白可參與細胞凋亡過程，與促凋亡蛋白Bax表達上調和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達下調有關。RBM5蛋白還能抑制細胞周期蛋白A表達，誘導細胞周期G1期阻滯。此外，在順鉑耐藥的肺腺癌細胞中，RBM5蛋白還能增強肺腺癌細胞對順鉑的化療敏感性。因此，涉及RBM5的靶向治療策略有可能成為NSCLC的有效治療方法［18］。

2.3.2.BM10 RBM10定位于人X染色體p11.3，其轉錄體包含24個外顯子。RBM10蛋白含930個氨基酸，是一種腫瘤抑制因子，能夠降低Bcl-x的Bcl-xS亞型與Bcl-xL亞型比例，導致自身基因失活，減少EGFR抑制劑介導的細胞凋亡，而其缺乏是對EGFR抑制劑治療反應不佳的標志［19］。RBM10蛋白可結合353種長鏈非編碼RNA（lncRNA），與核富集豐度轉錄物1（Neat1）有4個結合位點。RBM10蛋白主要位于Neat1的剪切異構體Neat1_2上，而Neat1具有致癌作用。在RBM10蛋白過表達的NSCLC中，Neatl_1比例增加，Neatl_2比例降低，說明RBM10蛋白通過可變剪切調節Neat1兩種可變剪切異構體的平衡，并通過PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號通路降低Neat1_2表達，抑制NSCLC細胞的侵襲和遷移［20］。此外，RBM10蛋白截短突變常見于EGFR L858R突變的NSCLC患者，這部分患者對EGFR抑制劑的敏感性降低，其臨床結局通常比EGFR exon19 del缺失的NSCLC患者差，并且腫瘤進展率高［19］。

2.4.cl-xL 根據功能不同，Bcl-2家族蛋白可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種。其中，Bax為促凋亡蛋白，而Bcl-2、Bcl-xL為抗凋亡蛋白。Bcl-xL可結合Bcl-2家族的促凋亡蛋白，如Bax、Bad，從而阻止促凋亡離子通道開放，抑制凋亡信號激活。選擇性抑制Bcl-xL可提高多西他賽在NSCLC中的臨床療效，并且不會引起明顯的骨髓毒性。但是，由于Bcl-xL選擇性抑制劑的臨床療效有限，目前還沒有藥物進入臨床試驗。研究表明，無法進入線粒體導致脫靶是Bcl-xL選擇性抑制劑A-1331852在實體瘤中療效不佳的重要原因。線粒體無毒小分子NA-2a通過轉運蛋白選擇性聚集在線粒體中，改變了線粒體膜的通透性，從而促進A-1331852進入線粒體并與其靶點結合，增加抗腫瘤活性。因此，NA-2a聯合A-1331852成為一種有前景的NSCLC治療選擇［21］。新型Bcl-2/Bcl-xL雙抑制劑APG1252-M與第三代EGFR抑制劑奧希替尼聯合使用，能夠誘導EGFR突變的NSCLC細胞凋亡，降低奧希替尼獲得性耐藥概率，有效抑制奧希替尼耐藥NSCLC細胞的增殖［22］。ABT263是一種可誘導細胞凋亡的小分子Bcl-2抑制劑，能夠通過靶向Bcl-2/Bcl-xL改善常氧條件下放療對腫瘤細胞的毒性作用，克服體內外暴露于急性或循環缺氧腫瘤細胞的放療抗性［23］。在高分化和中分化肺鱗癌中Bcl-xS表達顯著升高，其高表達與較高的總生存率顯著相關，是手術切除肺鱗癌患者預后良好的獨立預測因素［24］。

2.5.RSF SRSF是一類富絲氨酸/精氨酸的剪切因子，具有相似的結構域，即N末端的RNA識別結構域和C末端的富絲氨酸/精氨酸結構域。本文著重介紹SRSF5、SRSF9兩種最具臨床價值的可變剪切體。

2.5.1.RSF5 SRSF5參與前體mRNA的可變剪切及翻譯過程，其編碼蛋白在多種腫瘤中異常表達。SRSF5蛋白在肺癌中表達上調，尤其是在SCLC中的表達顯著高于肺腺癌或肺鱗癌。SRSF5蛋白對NSCLC胸腔積液中惡性細胞的鑒別診斷價值較高，優于臨床常用的腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）。SRSF5蛋白還能檢出CEA假陰性中70%非NSCLC患者。這提示SRSF5蛋白或可作為一種檢測SCLC和胸膜轉移的新型標志物［25］。

2.5.2.RSF9 SRSF9定位于人12號染色體，其編碼蛋白在腦、結腸、肺及皮膚等部位惡性腫瘤組織中高表達。在肺腺癌中，SRSF9蛋白高表達與腫瘤突變負荷及患者總生存期呈正相關關系，這為肺腺癌預后評估提供了新的思路；在肺鱗癌中，SRSF9蛋白表達與B細胞、中性粒細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等六種免疫浸潤細胞呈負相關關系，而與腫瘤純度呈正相關關系，提示SRSF9可能通過免疫抑制作用影響肺鱗癌進展。因此，SRSF9在NSCLC免疫治療和預后評估方面表現出一定優勢［26］。

2.6.DD3 細胞骨架基因在調節腫瘤細胞生長和遷移中起關鍵作用。Adducin屬于膜骨架蛋白家族，由ADD1、ADD2和ADD3編碼，分別映射至染色體三個不同位置，其中ADD3編碼蛋白對維持細胞骨架至關重要。ADD3定位于人染色體功能性腫瘤抑制區域10q25.1-25.2，其編碼蛋白除了作為細胞骨架蛋白外，還是腫瘤細胞生長的負性調節因子，其表達變化與腫瘤惡性表型和臨床預后呈負相關關系［27］。人類ADD3共有15個外顯子，其中外顯子14易發生可變剪切。QKI-5以位置依賴性方式與內含子13的3'端多個位點結合，抑制ADD3外顯子14可變剪切，從而抑制腫瘤的發生、發展。ADD3的總mRNA水平在腫瘤組織與正常組織之間相差無幾，但由于mRNA存在可變剪切這一特殊的加工方式，不同的外顯子進行拼接產生不同的剪切產物。有研究報道，受腫瘤微環境的影響，ADD3外顯子14表達在肺癌組織中上調1.43～3.76倍，并且其表達與患者生存期和QKI mRNA表達呈負相關關系［28］。在ADD3 16個外顯子中，外顯子15傾向于在NSCLC中表達，而在正常肺組織中不表達，在高轉移性乳腺癌中亦有同樣趨勢，這表明ADD3特異性可變剪切體可能在腫瘤的發生、發展中具有重要作用，或可作為一種新的腫瘤生物標志物預測腫瘤的發生、發展［29］。

綜上所述，可變剪切是調節基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制，可變剪切基因異常幾乎與腫瘤細胞的所有特征表型有關，能夠參與多種腫瘤的發生、發展以及治療耐藥。在NSCLC中的可變剪切基因主要有MET、GLDC、RBM、Bcl-xL、SRSF、ADD3等，這些可變剪切基因能夠參與NSCLC細胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物學行為。近年在可變剪切領域的研究中取得了巨大進展，很大程度上促進了腫瘤靶向藥物的研發。但關于NSCLC預后標志物或治療靶點的潛在可變剪切基因還有很多，許多基于可變剪切的靶向治療還遠未進入臨床試驗階段，仍需進一步探索。