河西走廊玉米大斑病菌0號生理小種生物學特性研究

雷玉明，鄭天翔，邢會琴，程紅玉，趙文勤，趙文明

1.河西學院農業與生態工程學院，甘肅 張掖 734000 2.甘肅河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000 3.河西學院祁連山有害生物綜合治理中心，甘肅 張掖 734000 4.德光農業科技開發有限責任公司，甘肅 張掖 734000

玉米大斑病是由大斑凸臍蠕孢菌[Exserohilumturcicum(Pass.)LeonardetSuggs.]引起的一種威脅玉米生產的重要葉部病害。1876年在意大利首次發現，已遍布世界五大洲的所有玉米產區[1]。我國最早在1899年就有大斑病發生的記載，后遍及全國，以東北、西北、華北北部、南方冷涼山區的玉米產區發生較重[2]。20世紀80年代，由于引進高抗大斑病自交系Mo17，培育和推廣抗大斑病的雜交種，有效控制了田間大斑病的發生[3]。近幾年來，我國玉米種植區大斑病連年普遍發生，黃淮海、西北、東北等地大面積推行秸稈還田造成大斑病菌源積累量增大，東北、華北主栽品種抗病性普遍較差，2021年大斑病在東北、華北、西南、西北等大部分地區中等發生，局部偏重發生，發生面積達433 hm2[4]。王春明等[5]報道97份玉米雜交種對大斑病菌抗性鑒定，發現46.39%品種為感病和高感品種，病情分級達5～9級；孫瑞東等[6]對185份玉米種質抗大斑病菌分析，發現41.08%材料病斑面積在28%～96%之間，表現為感病和高感材料。雷玉明等[7-8]報道甘肅河西走廊玉米制種田真菌性病害達46種，其中大斑病發病率達48.63%，因受土地連作及抗病性差的親本組合大面積單一種植、病原菌越冬基數增多、病原種群變化大、病原傳播途徑多等因素的影響，玉米大斑病呈逐年加重趨勢，成為嚴重威脅玉米種子生產的主要病害。目前馬周杰等[9]、戴冬青等[10]報道遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古、甘肅、寧夏、河北、山西、陜西、河南、山東、安徽等12個省份大斑病菌生理小種與交配型及遺傳多樣性，郭建國等[11]明確了甘肅河西走廊大斑病菌以0號為優勢生理小種。但對甘肅獨特地理環境和氣候條件下的玉米大斑病的研究報道較少，特別是對其生物學特性尚未見系統研究。因此，以甘肅河西走廊玉米制種田大斑病為研究對象，系統研究大斑病菌的生物學特性，分析環境因子對病菌菌絲生長、產孢、孢子萌發的影響，可為河西走廊玉米大斑病的流行規律探討和病害的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

玉米大斑凸臍孺孢病菌0號生理小種由河西學院農業與生態工程學院植物病理實驗室提供。將純化菌株接種于PSA平板，25 ℃恒溫擴大培養6～7 d，制作成活化菌株平板，用于采集菌餅和配制孢子懸浮液。用10 mL無菌水將培養6～7 d菌株平板孢子洗下，配成1×106～1×107的孢子懸浮液備用。

1.2 不同溫度對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

采用PSA培養基，用直徑7 mm打孔器從菌落邊緣取圓形菌塊，置于PSA平板中央，設置5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃共9個溫度梯度，每處理重復3次。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，利用紐鮑爾(Neubauer)血球計數板測定產孢量[12]。孢子萌發測定的溫度設置同前，吸取懸浮液1 mL采用凹玻片萌發法，重復3次，24 h后以孢子芽管長度大于1/2孢子寬度時視為萌發，測定孢子萌發率。

1.3 不同pH對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

pH設3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共計9個梯度(用0.1%HCl和NaOH調節)。25 ℃恒溫培養，分別測定病菌菌落直徑和產孢量、孢子萌發率[12]。

1.4 不同光照對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

設24 h/d全光照、12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗、24 h/d全黑暗3種光照處理[12]。

1.5 7種碳源對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

以PSA為基礎培養基，分別將蔗糖等量替換為葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖、乳糖、淀粉，以不加碳源為對照(CK)[12]。病菌菌落直徑和產孢量測定方法與1.2相同。孢子萌發試驗，將供試碳源按照2%濃度配制成培養液，分別吸取孢子懸浮液0.5 mL與2%碳源培養液0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌發法，無菌水為對照(CK)，25 ℃恒溫保濕培養。重復3次，24 h后測定孢子萌發率[13]。

1.6 7種氮源對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

以PSA為基礎培養基，分別以0.5%的量加入硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、硫酸銨、氯化銨[12]，以不加氮源為對照(CK)，測定病菌的菌落直徑和產孢量。孢子萌發的試驗方法與1.5相同[13]。

1.7 菌絲致死溫度測定

將直徑7 mm的菌餅置于裝有無菌水的試管中，每管10塊，將試管分別置于45～60 ℃(溫差1 ℃)的恒溫水浴鍋中，共計16個溫度梯度，處理10 min(預熱1 min左右)，迅速冷卻后移植于PSA平板培養基，每皿3塊，25 ℃恒溫培養，每處理3次重復。7 d后觀察菌絲生長狀況，以無菌絲生長視為死亡，確定菌絲致死溫度[13]。

1.8 分生孢子致死溫度測定

取5 mL孢子懸浮液裝入無菌試管中，將試管分別置于45～60 ℃(梯度間隔為1 ℃)恒溫水浴鍋中處理10 min(預熱1 min左右)，12 h后測定孢子萌發率[13]。

1.9 數據處理

采用DPS 12.5數據處理系統Duncan’s新復極差測驗法進行差異顯著性分析。孢子萌發率計算公式：孢子萌發率=(萌發的孢子數/試驗的孢子總數)×100%[8,13]。

2 結果與分析

2.1 溫度對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

測定結果(見圖1)表明，病菌菌絲生長、分生孢子產孢、孢子萌發的溫度范圍較廣，在5～40 ℃時均可生長，生長速度差異顯著。在28 ℃時生長最快，菌落平均直徑達84.4 mm/7 d；其次為25、30 ℃，菌落平均直徑分別達75.23 mm/7 d和75.33 mm/7 d；溫度低于10 ℃和高于35 ℃生長緩慢，表明該菌菌絲生長的適宜溫度為25～30 ℃。病菌在15～40 ℃間均可產孢，產孢量差異顯著。28 ℃時產孢量最大，達8.67×104個/mL，溫度低于15 ℃和高于40 ℃產孢量顯著下降，表明低溫或高溫環境抑制產孢。分生孢子萌發對溫度的要求范圍較廣，在5～40 ℃時均可萌發。25 ℃時孢子萌發率最高，達92.33%；其次為28 ℃，萌發率達85.33%；溫度≥30 ℃或≤20 ℃均抑制孢子萌發，表明該菌分生孢子萌發最適溫度為25～28 ℃(見圖2)。

2.2 pH對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

試驗結果(見圖3)表明，病菌菌絲生長的pH適應范圍廣泛，在pH 3～11范圍均能生長，生長速度差異顯著。最適pH為7和8，生長速度最快，菌落平均直徑分別達77.33 mm/7 d和77.87 mm/7 d；pH 3～5和pH 10～11菌絲雖能正常生長，但生長緩慢。pH 3～11范圍均能產孢，但產孢差異顯著，pH 7時病菌產孢量最高，達7.03×105個/mL；其次是pH 8，達6.93×105個/mL；pH 3～6和pH 9～11雖能產孢，但產孢量顯著下降，表明pH 7～8是適宜的產孢范圍。分生孢子在pH 3～11均能萌發，pH 7時萌發率最高，達80.67%；其次為pH 6和pH 8，分別達70.67%和70.33%；pH 3～5和pH 9～11分生孢子雖能萌發，但萌發率顯著降低，表明分生孢子萌發適宜pH為6～8(見圖4)。

2.3 光照對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

試驗結果表明，不同光照條件下菌絲生長差異顯著，12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗生長最快，菌落直徑達63.33 mm，全黑暗條件下生長速度居中，全光照條件生長最慢。在不同光照處理下產孢量差異顯著，半光半暗、全黑暗條件下產孢量較大，分別達7.67×104個/mL、6.67×104個/mL，全光照條件下產孢量較少。分生孢子在3種光照處理下均能萌發，差異顯著，半光半暗、全黑暗條件下萌發率較高，分別達91.67%、91.00%，全光照條件萌發率最差。

2.4 碳源對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

從測定結果(見圖5)可見，病菌對供試7種碳源的利用情況存在差異。菌絲在葡萄糖和木糖為碳源培養基中生長最好，菌落平均直徑分別達65.40 mm/7 d和64.47 mm/7 d；其次為果糖和蔗糖，菌落平均直徑分別達57.37 mm/7 d和57.60 mm/7 d；淀粉培養基中菌絲生長緩慢。從產孢量看，以果糖和乳糖、木糖為碳源培養基中產孢量最多，達6.67×104個/mL、6.00×104個/mL，其次為蔗糖，在淀粉培養基中產孢量與對照無差異。從對分生孢子萌發影響看，在葡萄糖溶液中萌發率最高，為80.60%；其次在木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖溶液中萌發良好，對分生孢子萌發具有促進作用；而乳糖和淀粉溶液中萌發率低于無菌水對照，可見乳糖和淀粉抑制分生孢子萌發(見圖6)。

2.5 氮源對病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響

從測定結果(見圖7)可見，病菌對氮源的利用表現明顯差異。其中甘氨酸最適合菌絲生長，菌落平均直徑達75.73 mm/7 d；在以酵母膏和蛋白胨為氮源的培養基上生長良好，分別達59.83 mm/7 d、60.10 mm/7 d；而以硝酸鉀、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨等為氮源的培養基上菌絲生長較差，生長量明顯低于不加氮源對照，說明這4種氮源抑制菌絲生長。從產孢量看，供試7種氮源的培養基中產孢量較不加氮源對照的明顯減少，說明氮源對分生孢子產生具有抑制作用。從對分生孢子萌發影響看，在蛋白胨溶液中萌發率最高，為87.30%；其次是牛肉膏、甘氨酸，萌發率為77.50%～78.80%，顯著高于無菌水對照萌發率；而在硝酸鉀、酵母膏、硫酸銨、氯化銨溶液中分生孢子萌發率顯著低于無菌水對照，說明對分生孢子萌發有抑制作用(見圖8)。

2.6 菌絲和分生孢子的致死溫度

測定結果表明，在溫度≥55 ℃時，未見菌絲生長，確定菌絲致死溫度為55 ℃，10 min。當溫度≥57 ℃時，分生孢子均不萌發，確定病菌分生孢子致死溫度為57 ℃，10 min。

3 結論與討論

本研究結果表明，河西走廊病菌生長的溫度范圍廣泛，在5～40 ℃范圍內菌絲和分生孢子均生長萌發，15～40 ℃范圍內可產孢。菌絲生長的適宜溫度為25～30 ℃，菌絲和產孢最適溫度28 ℃，病菌在15～40 ℃間均可產孢，分生孢子萌發最適宜為25～28 ℃，25 ℃萌發率最高，菌絲致死溫度為55 ℃，分生孢子的致死溫度57 ℃。浦子鋼[14]報道黑龍江西部地區的玉米大斑病菌菌絲生長的最適溫度為20～30 ℃，上限溫度達35 ℃，菌絲生長速度為0，30 ℃孢子萌發率最高。張治家等[15]報道山西省侯馬地區玉米大斑菌株菌絲生長溫度范圍10～30 ℃，陽曲、靜樂、屯留嶺等地區菌株15～30 ℃，最適溫度為25 ℃，10、40 ℃菌絲仍然生長。馮勝澤等[16]研究表明，大斑病菌在15、35 ℃均不產生分生孢子，25 ℃為病菌分生孢子產生的最適溫度。本研究在菌絲生長的溫度范圍，最適溫度的上、下限，產孢與孢子萌發的最適溫度方面與前人研究結果均存在差異，分析認為與該菌因地理區域、環境差異而存在不同生理小種的分布相關。董金皋等[17]報道玉米大斑病1、2號生理小種在菌絲生長速度、菌絲生長量、孢子產生量以及致病毒素產生量等生物學特性方面的溫度效應存在著一定的差異，進一步證實了這一相關性。楊信東等[18-19]對玉米大斑病田間病葉病斑研究表明，病斑上的病菌在5 ℃以下、35 ℃以上基本不能產孢，在10 ℃以上開始產孢，產孢適溫大體在20～26 ℃，25 ℃孢子萌發率最高，達96%，孢子萌發、附著孢形成與侵入適溫大體在20～27 ℃，這一規律與本研究結果相似。這些特性與該病害每年8月高溫季節在甘肅河西走廊玉米田易于發生流行基本吻合。因此，這一試驗結果可為玉米大斑病生理小種監測、流行預測和防治提供科學依據。

試驗結果表明，該菌在pH 3～11的環境中菌絲和分生孢子均能生長萌發，pH 7和8時菌絲生長最快；pH 7時產孢量7.03×105個/mL為最多，pH 8產孢量次之；分生孢子萌發適宜pH為6～8，pH 7時萌發率最高，達80.67%。其變化趨勢表明，該菌在弱堿性條件下有利于菌絲生長與孢子萌發，在中性偏堿環境下有利于產孢。浦子鋼[14]報道pH 7時菌落直徑增長最快，pH 6～10生長均表現良好，pH 7時孢子萌發率最高為78.9%，pH >8萌發率有所下降，弱堿條件下生長略優于酸性條件，這一變化規律與本研究結果相吻合。與宋文靜等[20]報道河北省玉米大斑病菌0號小種的孢子萌發最適pH 5.0～7.0存在差異，說明不同菌株孢子萌發對酸堿適應性存在差異。因此，在生產上采取檢測葉部大斑病菌生長擴展的菌態，有針對性的選擇偏酸或偏堿性的殺菌劑葉面噴霧，以抑制菌絲生長、產孢和孢子萌發，降低侵染機率，達到防治大斑病的目的。

本研究結果表明，12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗環境下菌絲生長最快，半光半暗、全黑暗條件下產孢量和萌發率最大，與馮勝澤等[16]、姜開梅等[21]報道的12 h光暗交替培養條件下有利于菌絲生長和產孢量最大的研究結果相一致。本研究結果證實了低光照條件有利于該病害的發生規律，與該病害在田間易出現于中下部葉片的規律相吻合。因此，在生產實踐中通過調整種植密度，改善田間光照條件，減輕病害的發生。

從碳源、氮源對該菌生長和產孢影響試驗看，該菌對營養成分的需求存在一定差異，最有利于菌絲生長碳源為葡萄糖和木糖，最佳氮源為甘氨酸；最有利于產孢的碳源為果糖和乳糖、木糖；最利于孢子萌發的碳源為葡萄糖溶液，氮源為蛋白胨溶液；供試7種氮源的產孢量顯著低于無菌水對照處理，氯化銨、硫酸銨等無機氮源對產孢和孢子萌發具有抑制作用，這一結果與浦子鋼[14]、馮勝澤等[16]前人研究結果相一致。楊信東等[22]試驗證實，大斑病對氮肥比較敏感，肥力水平與大斑病菌侵染機率呈顯著負相關，肥力水平較高條件下大斑病發生較輕。因此，本試驗結果為研究玉米田間肥力水平對大斑病菌的抗性機制提供了科學依據。