線粒體DNA單倍群與漢族人群帕金森病的相關性

羅慶 文霞 鐘敏 周家紅 呂志宇 劉靳波

(西南醫科大學附屬醫院 1醫學檢驗部,四川 瀘州 646000;2神經內科)

帕金森病(PD)是中老年人常見的神經系統退行性疾病,其病理機制尚不清楚〔1〕,有證據表明線粒體功能障礙在PD發病機制中起關鍵作用〔2〕。線粒體DNA(mtDNA)單倍群是共享某些古老變體的mtDNA單倍型的組,它們在某種程度上反映了對環境和自然選擇的適應,并且在不同種族的人口中有所不同〔3〕,且在進化和遷移過程中形成并呈現出大陸特定分布〔4〕,在中國漢族群體南北不同地區存在地理分化〔5〕。

mtDNA單倍群被發現與自閉癥譜系障礙〔6〕、阿爾茨海默病〔7〕、精神分裂癥〔8〕等多種疾病有關。PD的風險和mtDNA變異之間的關聯已在白種人中得到廣泛研究。與之形成鮮明對比的是,在中國人群的mtDNA變體與PD中的相關研究較少且還存在爭議。mtDNA多態的具有地區差異,尚缺乏在中國西南地區漢族人群的相關研究。因此本研究探討線粒體D環(D-loop)控制區多態位點及mtDNA單倍群與漢族人群PD的遺傳易感性。

1 對象和方法

1.1研究對象 收集2018年7月年至2019年12月于西南醫科大學附屬醫院神經內科就診的門診及住院治療的散發原發性PD患者219例(PD組),病例之間無直接血緣關系,其中男109例,女110例,年齡42～91歲,平均(69.64±10.47)歲。病例均為中國漢族人群。且入組病例均經過兩名神經內科醫生的獨立檢查,采集相關信息及病史,排除家族性及繼發性PD。對照組來自同一區域的漢族人群,共233例。年齡44～88歲,平均(62.85±9.51)歲,其中男136例,女97例,親緣家屬中無PD患者,且經過系統的病史采集與體格檢查排除原發及繼發性PD。診斷標準PD的診斷標準根據2015年國際運動障礙學會(MDS)推出的PD的臨床診斷最新標準〔9〕。

1.2PCR及測序 血液基因組DNA的提取,進行濃度與純度檢測。檢測合格后,進行mtDNA高變區片段的擴增,采用引物〔10〕:擴增引物L15594(正向5′-CGCCTACACAATTCTCCGATC-3′)與H901(5′-反向ACTTGGGTTAATCGTGTGACC-3′),測序引物L15811(正向5′-TCATTGGACAAGTAGCATCC-3′)、H11反向(5′-CGTGAGTGGTTAATAGGGTGATAG-3′)、L16410正向(5′-GTCCCTTGACCACCATCCTC-3′)、H665反向(5′-TAAGAGCTAATAGAAAGG-3′)。PCR擴增完成后經1.5%凝膠電泳鑒定,將PCR產物進行sanger 測序。

1.3測序數據分析 測序結果采用DNA分析工具seqman軟件進行組裝。使用MitoTool軟件(http://www.mitotool.org)〔11〕根據修訂的劍橋參考序列分析DNA序列以鑒定堿基中的變體。計算出每個樣品突變的數量及每個突變的總數量,選擇群組中總體突變頻率大于5%用于進一步分析。根據最新人類系統發育樹(Phylotree,mtDNA tree Build 17)確定單倍群及亞單倍群〔12〕。某些通過D-loop測序無法區分的單倍群則結合mtDNA編碼區相應的SNPs酶切的結果來分析。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。PD組和對照組的遺傳同質性檢驗使用多重對應分析進行評估。χ2檢驗用于評估性別差異,樣本年齡正態性檢驗符合后,使用Mann-WhitneyU檢驗評估年齡差異。使用性別和年齡為協變量的二元邏輯Logistic回歸模型分析PD組與對照組SNPs等位基因和單倍群的頻率,計算比值比(OR)和 95%置信區間(95%CI)。

2 結 果

2.1D-loop控制區域測序結果分析 PCR擴增產物片段為1 876 bp,包括線粒體D-loop控制區域、MT-TF基因和部分的MT-RNR1基因。在452例受檢者中一共檢測到338個變體,包括突變、插入和缺失。采用最小等位基因頻率(MAF)>5%,發現有49個SNP位點、2個缺失和3個插入。這些位點的D-loop位置、堿基改變、所占的頻率、位于高變區位置及其功能位置見表1。

表1 鑒定出的頻率大于5%的54個變體

2.2病例組與對照組的同質性分析 采用篩選出的54個頻率>5%的變體對兩組樣本進行多重對應分析。結果表明兩組質心重疊,這表明病例和對照在遺傳背景上非常匹配(圖1)。遺傳同質性較高,兩組樣本的種群來源相近,可以用于統計學分析。

(1)+:每個檢測樣本;1:PD患者,2對照組;(2)O:分別為病例組和對照組的質心圖1 PD組與對照組D-loop區域變體的多重對應分析

2.3D-loop控制區域多態性與PD的相關性 使用年齡和性別作為協變量進行邏輯回歸分析。首先對個體攜帶D-loop控制區域的變體個數與PD的相關性進行統計學分析。攜帶變體個數與PD的發病風險無關(P>0.05)。對54個SNP與PD發病風險的關系進行了逐一鑒定。5個SNP與PD顯著相關,分別為:320C/T、16140T/C、16189T/C、16224T/C、16290C/T。320C/T、16189C/T、16224T/C與16290C/T在PD患者中的攜帶頻率明顯高于對照組。而16140T/C在PD組的攜帶頻率較對照組明顯偏低。見表2。

表2 鑒定出的與PD風險相關的變體〔n(%)〕

2.4線粒體DNA單倍群與PD相關性 依據D-loop控制區域測序結果序列并結合編碼區序列的分析,實驗樣本被劃分為不同的單倍群,主要為L3的子單倍群N和M。在233例對照組中,最常見的單倍群是D (18.88%),其次是單倍群 B (15.88%)、R9(12.45%)、F(10.31%)、A (8.15%)。在亞單倍群中最常見的是D4(12.87%)。通過Logistic回歸分析結果顯示,PD組和對照組之間未檢測到單倍群頻率的差異(P>0.05)。見表3。但在單倍群B(P=0.078,OR=0.623,95%CI=0.369～1.054)和單倍群B4中發現與PD的存在邊際顯著關聯。通過分層分析發現,在男性中單倍群R9(P=0.045,OR=0.396,95%CI=0.160～0.980)和單倍群F(P=0.038,OR=0.354,95%CI=0.132～0.945)在兩組之間存在顯著性差異。在女性中,單倍群M7(P=0.016,OR=0.260,95%CI=0.087～0.779)在PD組與對照組之間也具有顯著性差異。因此在中國西南地區四川漢族人群中,線粒體DNA單倍群與PD的發病風險存在相關性。

3 討 論

線粒體基因組的D-loop區域的功能仍然知之甚少,目前的研究〔13〕表明與線粒體DNA復制、脫氧核糖核酸(dNTP)代謝、DNA重組、DNA拓撲等功能具有密切作用。因此D-loop區發生變異,可能會影響其調控復制和轉錄的作用,進一步影響細胞的能量代謝,從而致病。

Wu等〔14〕第1個對亞洲人群中通過對D-loop區域進行測序后分析與PD相關的mtDNA變異,結果表明與PD密切相關的是6個SNP,包括151T/C、189G/A、318C/T、16086C/T、16134T/C和16271C/T。Liou等〔10〕研究雖然不是對D-loop區域進行全測序,但發現了3個D-loop T146C、T16189C、G16319A與PD的發病風險顯著相關。這與本研究結果均不一致,無法復制出相似的變體。可能的原因首先是由于D-loop控制區域的多態性較高,與PD相關的mtDNA多態位點具有人群差異。其次是因為本研究樣本量小,為差異提供了可能的解釋。再次由于mtDNA在不同民族及地理位置上存在不同的多態性及移民、遺傳選擇和環境等多種因素都有可能影響其多態性。D-loop區域多態性較高,與PD相關聯的SNPs具有明顯的地區差異,具有較高的特異性,因此不適用于作為PD普遍易感因子。

本研究未檢測四川地區漢族人群PD病例和對照之間的單倍群頻率差異。但在單倍群B和單倍群B4中發現與PD的存在邊際顯著關聯。在中國人群的研究中,一項小樣本研究來自中國福建漢族人群發現單倍型B可能會降低漢族人群早發型帕金森病(EOPD)和50歲以下人群的罹患EOPD的風險,而單倍型D可能會導致50歲以下人群發生PD的風險更高〔15〕。另一項兩階段來自中國臺灣人群的研究發現攜帶線粒體單倍體B5的受試者對PD具有抗藥性〔10〕。另一項分析mtDNA變體及其發生PD風險的研究來自浙江漢族人群表明,攜帶單體組A5的受試者易感,而單體組B5攜帶者對疾病的抵抗力更高〔14〕。同時該研究的空間分析表明單倍群B5分布與PD患病率之間呈負相關。而本研究未發現單倍群B或者B5與中國四川地區漢族人群PD發病風險的關聯,也沒有發現先前研究單倍群A5在PD患者與對照之間的差異。疾病和對照組之間缺乏足夠的患者數量或人群亞結構差異被認為是影響結果的主要原因〔16〕。很多單倍群相關的病例對照研究缺乏復制隊列這樣的第2個對照組。為了可靠地檢測單倍群與復雜人類疾病之間的關聯,需要非常大的病例和對照樣本量。

綜上,線粒體D-loop區變體及單倍群與PD的發病風險可能存在一定的相關性。雖然本研究樣本量較小,但擴充了漢族人群相關的數據,為將來多中心的研究提供一定的數據。而mtDNA SNPs及單倍群與PD的相關性還需更多大樣本研究來證實。