基于網絡藥理學結合正交設計優化復方降脂口服液的提取工藝

曹蕾, 鄒明慧, 秦雪瑩, 閆占寬, 馮靜, 高珣*, 秦昆明

(1.江蘇海洋大學藥學院, 連云港 222005; 2. 江蘇原創藥物研發有限公司, 連云港 222000; 3.遼寧省疾病預防控制中心, 沈陽 110000)

單純性肥胖是一種由于長期攝入過多熱量及消耗不充分,使得脂肪積累、脂質代謝紊亂的慢性代謝性疾病[1-3]。肥胖伴隨有糖尿病、高血壓以及心血管和腎臟疾病的發生,為了倡導全球各國關注超重和肥胖人群的預防控制,世界肥胖聯盟(World Obesity Federation, WOF)2020年宣布每年3月4日為“世界肥胖日”,根據《中國居民營養與慢性病狀況報告(2020年)》的最新數據顯示,目前中國的成人中已經有超過半數的人超重或肥胖,全國已經有6 億人超重和肥胖[4]。目前,最常見的是藥物治療,如氯卡色林、利拉魯肽、奧利司他等,然而這類化學藥物常出現消化道不良等副作用,中藥有望在該領域取得一席之地。中醫對肥胖的認識最早起源于《黃帝內經》,認為主要是因脾胃失調從而導致超重等。

依據中醫藥理論基礎,復方降脂口服液由焦山楂、赤小豆、決明子、荷葉、茯苓、薏苡仁、玫瑰花、陳皮、枸杞子9 味中藥組成。以焦山楂為君藥,現代藥理研究表明焦山楂及其焦香味可促進單純性肥胖大鼠胃動力,調節干細胞因子-受體酪氨酸激酶信號通路從而達到減肥作用[5-6];荷葉、決明子為臣藥,荷葉中的生物堿類、黃酮類以及決明子中蒽醌類、萘并吡喃酮類物質能夠調控mTOR信號通路、抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖,介導脂肪代謝相關酶的表達[7-9];配赤小豆、茯苓、薏苡仁利水消腫,陳皮、玫瑰花、枸杞子理氣調中、行氣解郁、滋補肝腎,諸藥合用,能夠針對單純性肥胖患者達到減肥降脂的效果[10]。為探究復方降脂口服液的最佳提取工藝,現基于網絡藥理學探究復方中治療單純性肥胖的活性成分、作用靶點以及信號通路[11],并篩選活性成分與作用靶點進行分子對接以闡明成分-靶點之間具有良好活性,同時分析處方中治療肥胖癥的主要活性成分,以此為測定指標進行單因素及正交設計優化工藝參數,為復方口服液后續生產提供試驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-TU-1901型紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);MS105DU型十萬分之一電子分析天平(梅特勒托利多儀器上海有限公司,精度為0.01 mg);BSM-120.4萬分之一電子天平(上海卓精電子科技有限公司);DZTW型加熱套、RE-52AA旋轉蒸發儀(上海力辰邦西儀器有限公司);DHG-9080A鼓風干燥箱(上海博珍儀器設備制造廠)。

1.2 藥材與試劑

焦山楂(批號:20050604)、赤小豆(批號:210801)、決明子(批號:210701)、茯苓(批號:22012002-1)、陳皮(批號:21032601)以及荷葉(批號:210601)均購自連云港市北京同仁堂藥房;枸杞子(批號:220424)、薏苡仁(批號:210524)及玫瑰花(批號:200628)均購自南京海源中藥飲片有限公司;蘆丁對照品(批號:PU001-0025,純度為99.0%)購自成都普思生物科技股份有限公司);無水乙醇、硝酸鋁[Al(NO3)3]、亞硝酸鈉(NaNO2)、氫氧化鈉(NaOH)均為分析級;水為實驗室自制超純水。

2 方法與結果

2.1 復方降脂口服液網絡藥理學研究

2.1.1 復方降脂口服液的活性成分及作用靶點篩選

通過TCMSP(http: //tcmspw.com)檢索復方降脂口服液的活性成分,以類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%為條件,以及相關文獻總結焦山楂中的活性成分[12-14]。將活性成分在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)轉成SMILES格式,并導入SwissTargetPrediction[11](http://www.swisstargetprediction.ch/)收集Probability≥0.12的作用靶點。最終篩選出復方中8味中藥的活性成分共有116種活性成分(去除重復),舍去未有靶點的活性成分,共得到390個作用靶點,結果如表1所示。

表1 復方降脂口服液的主要活性成分Table 1 Main active components of compound lipid-lowering oral liquid

2.1.2 單純性肥胖疾病靶點篩選

在Genecards(https://www.genecards.org/)數據庫中分別輸入關鍵詞“simple obesity”“obesity”“hyperlipidemia”獲得疾病靶點,并設定Relevance score≥10篩選疾病靶點207 個。將活性成分的作用靶點與肥胖癥疾病靶點導入Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/)在線平臺進行靶點交集,得到27 個交集靶點。

2.1.3 “中藥-活性成分-作用靶點”網絡構建與分析

將藥材中活性成分進行ID編號,其中含有9 個重復成分,以A1、B1、B2、C1、D1、E1、E2、G1、G2表示,分別代表的是槲皮素、豆甾醇、CLR、谷甾醇、環阿屯醇、α1-谷甾醇、亞油酸乙酯、β-谷甾醇、花青苷。將“中藥-活性成分-作用靶點”的網絡文件和屬性文件導入Cytoscape3.7.1軟件中構建網絡圖,如圖1所示。結果數據分析得出,該網絡共有490個節點,共有1 665條邊,其中Degree≥20的活性成分有24 種,分別來自焦山楂、荷葉、茯苓、玫瑰花、枸杞子這5味藥材,其中作用較強的化合物是槲皮素、維生素-E、山柰酚、異鼠李素等;Degree≥20的作用靶點有9 個,分別是CYP19A1、AR、PTPN1、ESR2、SHBG、ESR1、NR1H3、HMGCR、RORC。

綠色三角形表示中藥名稱,藍色菱形表示作用靶點,所有圓形表示中藥活性成分;JSZ為焦山楂;CXD為赤小豆;JMZ為決明子;HY為荷葉;FL為茯苓;YYR為薏苡仁;MGH為玫瑰花;CP為陳皮;GQZ為枸杞子圖1 “中藥-有效成分-作用靶點”網絡圖Fig.1 “Medicinal material-component-target” network diagram

2.1.4 PPI網絡的構建與分析

將27個交集靶點導入STRING(https: //string-db.org/)數據庫分析,構建PPI網絡如圖2所示。節點所顯示的形狀越大、顏色越深,說明該靶點的度(degree)就越高;邊的粗細反映連接評分(combined score)大小變化,邊越粗combined score越大。由可視化結果分析可知,得到27個節點和138條邊,平均節點值為10.2,其中AKT1、IL6、PPARG、TNF是在PPI網絡中有較高程度的節點,可能是肥胖癥的核心候選靶點。

圖2 PPI網絡圖Fig.2 PPI network diagram

2.1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

將交集靶點導入Metascape數據庫(https://metascape.org/)進行GO功能和KEGG通路富集分析,且采用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制富集圖。GO富集得到所有功能條目563 條,包括522 條生物過程條目(biological process,BP),31條分子功能條目(molecular function,MF)以及10 條細胞組成條目(cellular composition,CC)。其中生物過程主要包括防御反應的調節(regulation of defense response)、蛋白質磷酸化的正向調節(positive regulation of protein phosphorylation)、炎癥反應的調節(regulation of inflammatory response)、蛋白質激酶活性的調節(regulation of protein kinase activity)等,分子功能主要包括核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、核類固醇受體活性、脂質結合、類固醇結合等,細胞組分主要包括受體復合體、質膜外側、神經元細胞體等,如圖3所示。

圖3 GO功能富集分析網絡圖Fig.3 Network diagram of GO functional enrichment analysis

KEGG通路富集得到87 條信號通路,以富集程度(enrichment)、顯著性(lgP)值高于均值為標準,篩選出前10 條信號通路進行可視化分析,主要包括胰島素抵抗、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、脂肪分解調節、TNF信號通路、AMPK信號通路[15-18]等,如圖4所示。

圖4 KEGG通路分析圖Fig.4 KEGG pathway analysis diagram

2.1.6 “活性成分-作用靶點-信號通路”網絡構建與分析

為進一步探究中藥活性成分、作用靶點與信號通路之間的相互聯系,從KEGG通路富集分析數據中進行篩選,將各信號通路導入KEGG(https://www.kegg.jp/)中查詢信號通路與肥胖癥的聯系,獲得20 條與肥胖密切相關的關鍵信號通路,構建“活性成分-作用靶點-信號通路”網絡圖并進行拓撲分析, 如圖5所示。結果分析顯示,3β-羥基-羊毛甾-24-亞甲基-21-酸、槲皮素、山柰酚、異鼠李素為核心成分。

菱形表示作用靶點;長方形表示信號通路;圓形表示復方活性成分圖5 有效成分-關鍵靶點-主要通路網絡圖Fig.5 Components-key targets-main pathway network diagram

2.1.7 分子對接驗證

以PPI網絡圖中Degree值高低進行排序,選擇前3 個關鍵靶點(AKT1、IL6、PPARG)分別與“中藥-活性成分-作用靶點”網絡數據中3 個關鍵成分(4-羥基肉桂酸、異鼠李素、山柰酚)進行分子對接,從表2中分析發現與3 個核心靶點對接最低結合能的活性成分為異鼠李素,能與AKT1、IL6、PPARG可以較好結合,如圖6所示,分別是異鼠李素與AKT1、IL6、PPARG分子對接的2D、3D圖。

圖6 異鼠李素與AKT1、IL6、PPARG受體-配體相互作用2D、3D圖Fig.6 2D and 3D images of the interaction of isorhamnetin with AKT1, IL6 and PPARG receptor-ligand

表2 關鍵活性成分與核心靶點分子對接的分子結合力Table 2 Molecular binding force of key active ingredients for docking with core target molecules

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 溶液的配制

取蘆丁對照品約10 mg,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加入60%乙醇溶解稀釋定容至刻度,搖勻,即得蘆丁對照品溶液(400 μg/mL)。按處方稱取藥材125 g,加入1 500 mL量水,浸泡60 min后煎煮45 min,后下荷葉、玫瑰花、陳皮,共煎25 min,過濾濃縮至約200 mL,加水定容至250 mL。精密移取1 mL濃縮液,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇混合均勻,并定容至刻度,搖勻后過0.45 μm濾膜,即得供試品溶液。

2.2.2 檢測波長的選擇

精密移取適量2.2.1節下對照品溶液和供試品溶液,分別加入5% NaNO20.3 mL,搖勻放置6 min,再加入10% Al(NO3)30.3 mL,搖勻放置6 min,最后加入4% NaOH 4.0 mL,60%乙醇定容至10 mL,搖勻放置10 min[19]。以60%乙醇溶液作為空白,在400～900 nm波長范圍內進行全掃描。結果測得蘆丁對照品溶液最大吸收在509 nm處。

2.2.3 方法學考察

線性關系:精密移取對照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL,置于不同10 mL具塞比色管內,按照2.2.2節方法操作測定線性溶液的吸光度。以吸光度(Abs)作為縱坐標,溶液濃度C作為橫坐標進行線性繪圖,得到線性方程為A=0.011 6C-0.002 1(r2=0.999 7,n=5),表明蘆丁對照品溶液在0～96 μg/mL范圍內線性關系良好。

精密度試驗:分別精密移取蘆丁對照品溶液1.2 mL、供試品溶液1 mL,置于不同的10 mL具塞比色管中,連續測定6次,RSD分別為0.07%、0.26%,表明該方法儀器精密度、重復性良好。

穩定性試驗:精密移取蘆丁對照品溶液1.2 mL,在室溫下分別靜置0、10、20、30、40、50、60 min后進行測定。結果表明在室溫下顯色后60 min內穩定性良好,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.83%,因此檢測應在顯色后60 min內進行測定。

加樣回收率試驗:精密移取已知總黃酮含量的供試品溶液0.5 mL和蘆丁對照品溶液(400 μg/mL)0.6 mL置于10 mL比色管中,平行制備6份,測定吸光度并計算總黃酮含量(total flavonoid content,TFC)。結果得平均加樣回收率為104.89%,表明該方法的準確度良好。

2.3 干膏得率的測定

精密移取10 mL水提濃縮液置于蒸發皿(已干燥至恒重)中,水浴蒸干,置于105 ℃烘箱中干燥3 h后,于干燥器冷卻30 min,迅速稱定質量,再于105 ℃干燥1 h,冷卻稱定質量,反復干燥至恒定質量,計算干膏率。

2.4 復方降脂口服液提取工藝優化

2.4.1 單因素試驗結果分析

以不同的加水量A(500、750、1 000、1 250、1 500 mL)、浸泡時間B(20、30、40、60、70 min)、先煎時間C(30、45、60、75、90 min)、后下共煎時間D(5、15、25、35、45 min)為考察因素,進行加熱回流提取,以總黃酮含量和干膏得率為評價指標,確定各因素三水平[20],如表3所示。

表3 提取工藝正交試驗因素水平表Table 3 Levels and factors of the orthogonal of water extraction

2.4.2 正交設計試驗

在單因素試驗的基礎上,采用L9(34)正交試驗設計,以總黃酮含和干膏率為綜合評價指標(C),優化復方降脂口服液的提取工藝參數。

(1)

式(1)中:TFCi為測得總黃酮含量;TFCmax為測得最大總黃酮含量;Gi為測得干膏率;Gmax為測得最大干膏率。

如表4所示,直觀分析各因素對復方降脂口服液的提取工藝的影響依次為A>B>D>C。如表5所示,加水量對提取效果的影響具有顯著性(P<0.05)。最佳提取條件為A3B3C1D2,即加水量為1 500 mL、浸泡時間為60 min、先煎時間為45 min、后下共煎時間為25 min。

表4 正交實驗直觀分析表Table 4 Results of orthogonal test

表5 水提工藝試驗方差分析表Table 5 Analysis of variance of water extraction

2.4.3 工藝驗證

對優選的最佳工藝參數A3B3C1D2,進行工藝驗證,平行制備3份樣品,測定總黃酮含量及干膏率,如表6所示。在最佳提取工藝條件下,總黃酮含量和干膏率的RSD分別為1.26%和0.59%。

表6 工藝驗證結果Table 6 Results of process validation

3 討論與結論

肥胖是一種由遺傳、環境等多因素而引起能量代謝紊亂的慢性炎癥,中醫認為該癥與脾胃功能失調有關。復方降脂口服液依據中醫藥理論組成,能夠綜合調節機體以實現減肥降脂的功效,但藥理作用機制尚不明確。采用網絡藥理學方法,構建了“中藥-活性成分-作用靶點”和“活性成分-作用靶點-信號通路”調控網絡圖,篩選得到116種活性成分,其中大多數化合物歸屬于焦山楂、荷葉、決明子、茯苓、枸杞子這5味藥材,與中醫藥治療肥胖組方的用藥頻次一致[21-22];活性成分的作用靶點與單純性肥胖疾病靶點映射得到24個交集靶點,PPI網絡拓撲分析發現AKT1、IL6、PPARG、TNF是治療肥胖癥的關鍵靶點,且GO功能富集及KEGG通路富集分析得出本品治療單純性肥胖,主要作用于AKT1、IL6、PPARs、TNF、VEGFA等靶點,調控胰島素抵抗、AGE-RAGE信號通路、脂肪分解、AMPK、PI3K-Akt等信號通路,也有研究表明通過刺激腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL6、IL20)等的釋放激活胰島素抵抗、炎癥反應,從而緩解代謝綜合征[23];分子對接結果表明:異鼠李素、山柰酚與PPARG的結合力較好,且異李鼠素對AKT1、IL6、PPARG的結合能力均強于4-羥基肉桂酸、山柰酚;由此可見,該口服液通過多成分-多靶點-多通路-多生物途徑,實現治療單純性肥胖[24-26]。

通過網絡藥理學及分子對接技術對復方降脂口服液治療單純性肥胖的作用機制進行了預測,并篩選出其治療肥胖的活性成分如黃酮類、有機酸類、甾醇類化合物,其中絕大多數物質為黃酮類化合物?；诖?以總黃酮含量及干膏得率作為評價指標,采用先煎后下的提取方式考察加水量、浸泡時間、先煎時間、后下共煎時間對提取工藝的影響,確定最佳提取工藝條件為加水量1 500 mL、浸泡60 min后煎煮45 min,后下荷葉、陳皮、玫瑰花共煎25 min,并工藝驗證該提取條件穩定可靠,可為后續進行工業生產奠定理論基礎。