食源性細菌檢測中實時熒光定量PCR技術的應用效果研究

楊帆（天津市靜海區疾病預防控制中心,天津 301600）

食品是人類賴以生存及發展的物質基礎，而食物安全問題更是關系到人體健康及民生的重要社會問題之一，已經引起了人們的高度重視。近些年來，我國因世界范圍內大規模生物污染所導致的食源性疾病暴發事件在日常生活中屢見不鮮。例如奶粉中含有金黃色葡萄球菌、日本出血性大腸埃希菌污染、法國李斯特菌中毒以及世界范圍內的SARS流行等[1]。生活中所涉及的食品污染總共分為三類，第一類為化學性污染，主要是重金屬污染物、化學殘留物等；第二類為物理性污染，表現為放射性物質對食品的污染；第三類在生活中最為常見，為昆蟲、寄生蟲、微生物等對食品的污染。據權威數據統計，全世界每年會有15億以上的腹瀉患者，其中有70%的患者是因食用了被微生物污染的食品而發病的。我國則是以細菌毒素及細菌所造成的污染危害最大[2]。其中細菌感染型中毒潛伏時期較長，通常為十余個小時，且伴有發燒癥狀；而毒素型中毒時間僅為2-4個小時，很少會出現發燒的問題。從檢測方式上看，目前包括我國在內的許多國家仍有部門應用傳統的細菌培養鑒定方式對食源性致病菌進行檢測[3]。這類檢測方式的不足之處在于靈敏度低、操作繁瑣及檢測周期長，因此細菌檢測方式在臨床上應用則顯得尤為滯后。因此需要引入一類特異性及敏感性均較強的檢測方式進行檢測，這對于明確致病菌的類型以及促進早期診療的開展均有著可觀的臨床應用價值。筆者引入了基于分子生物學的FQ-PCR檢測技術，最終取得了較為可觀的檢出結果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 對象資料 抽取天津市靜海區疾病預防中心2021年5月-2022年5月之間發生群體食源性中毒腹瀉和疑似患者共計100例，分別取其糞便標本60份，嘔吐物標本40份，共計100份標本作為研究材料，對其中所含有的食源性致病菌進行測定。

1.2 方法 （1）儀器及試劑：PCR擴增儀為美國某公司生產，分析軟件由廠家提供。另選取試劑包括FQ-PCR熒光染料、DNA聚合酶、細菌基因組提取試劑盒、離心機。（2）細菌培養檢測方式：金黃色葡萄球菌、沙門菌、志賀菌及副溶血性弧菌均按照國家標準的細菌培養法和自動化微生物分析儀進行測定。（3）FQ-PCR檢測方式：①熱裂解法提取樣本DNA：取細菌培養液10ml置于試管中，按照8000r/min的速率進行離心。將其滅菌后應用蒸餾水進行2次洗滌。然后應用1ml蒸餾水進行懸浮處理，最后將樣本用水煮沸10min，按照8000r/min進行離心，取上清液，即為DNA模板液。②PCR擴增：在PCR擴增儀上進行擴增檢測，并按照說明書要求分別配置擴增液，調節循環參數。

1.3 觀察指標 ①FQ-PCR試劑盒特異性分析：選取導致食源性中毒的6個特異性菌株與導致食源性中毒的14個無關菌株各5份作為檢測樣本，計算FQ-PCR試劑盒的特異性水平。②FQ-PCR試劑盒的靈敏度及線性范圍：將本次檢測所分離鑒定出的菌株進行分離檢測，按照初始濃度2×107cfu進行10倍梯度稀釋，然后按照上述方法中所提及的方式進行PCR擴增。對照方式采用平板培養法，組中測算出試劑盒的線性范圍及靈敏度水平。③不同方式檢出結果：比較細菌培養法及FQ-PCR法對沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、諾如病毒及輪狀病毒的檢出率，并將結果以百分比形式表達。

1.4 統計學分析 借助SPSS26.0軟件進行數據分析，計量資料組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示數據存在比對價值。

2 結果

2.1 FQ-PCR技術靈敏度 通過定量對照模板進行10倍稀釋，并取7個濃度（2×10-2×107拷貝/ml），并對其進行實時定量PCR方式檢測。最終測定結果顯示，模板在2×102-2×107拷貝/ml范圍之間與其對應的CT值具有良好的相關性，相關系數大于＞0.999。即為FQ-PCR方式能夠對2×102-2×107拷貝/ml之間的食源性細菌病原體進行精準定量測量。具體相關性曲線圖詳見圖1。

圖1 FQ-PCR技術靈敏度相關性曲線圖

2.2 細菌培養法陽性檢出結果 由表1可知，細菌培養法共檢出沙門菌5份、志賀菌41份、副溶血性弧菌5份、金黃色葡萄球菌6份、諾如病毒5份、輪狀病毒1份，總陽性檢出數63份，總陽性率為63.00%。

表1 細菌培養法陽性檢出結果

2.3 FQ-PCR法陽性檢出結果 由表2可知，FQ-PCR法共檢出沙門菌7份、志賀菌58份、副溶血性弧菌10份、金黃色葡萄球菌9份、諾如病毒7份、輪狀病毒1份，總陽性檢出數92份，總陽性率為92.00%。

表2 FQ-PCR法陽性檢出結果

2.4 不同方式檢測結果比較 FQ-PCR法陽性檢出份數為92份，細菌培養法陽性檢出樣本份數為63份，差異有統計學意義（χ2=24.114，P=0.000）。

3 討論

食品在生產、運輸、銷售的各個環節中很容易受到微生物的污染。故在當前的食品衛生檢驗工作中，非常重要的一個要求即為準確、及時地將食品中的有害微生物予以檢出，避免有害食物流向市場。當前，隨著人們生活水平及保健意識的不斷提升，大眾對于食品衛生安全的關注度也在與日俱增。因此，需要在食品生產的各個環節中均進行檢測，保證食品在生產過程中的安全，使食品食用時的安全性得到有效保障。

從檢測手段上看，傳統的微生物檢測方式主要是根據食品的生理性狀及形態特征進行細菌分離、培養及一系列生化反應的檢測方式。檢測步驟用時較長，且操作比較繁瑣，特別是部分細菌往往不能得出理想的鑒定結果，同時在細菌檢測的實際應用過程中，還會出現結果出具時間與實際需求不匹配的情況。當前隨著食品細菌檢測技術應用的不斷增多，臨床上可應用的細菌檢測方法與手段也變得愈發多元化，可應用的檢測儀器也越來越靈敏。如何采用準確、經濟且快捷的檢測方式為當前食品安全檢測需重點關注的問題。從當前的發展趨勢上看，食品檢測需要體現出快速、準確的特點。在食品運輸的過程中，進出口商檢、質檢人員、質控人員及食品生產經營企業都需要政府部門能夠在短時間內取得準確且及時的質控結果。故應用一類省力、省時且成本低的檢測方式是社會各界所迫切需要的。

本次研究中則是在常見的食源性病毒檢測中引入了FQ-PCR技術作為支持，最終檢測結果較為可觀：FQ-PCR法陽性檢出份數為92份，高于細菌培養法陽性檢出樣本份數，差異有統計學意義（χ2=24.114，P=0.000）。這一結果說明，應用FQ-PCR技術相較于細菌檢測技術對食源性細菌的檢出率更高。對本次研究中所涉及的檢測菌種進行分析：①沙門菌屬：其屬于導致食物中毒最常見的致病菌類型，位居我國食物中毒的第一位菌種。食源性中毒所感染的菌種一般是由豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏菌所引起的。當菌種進入到腸道中，則會大量繁殖，使得腸道黏膜發炎。在反應過程中，大量活菌釋放所產生的內毒素還將導致患者機體出現中毒的表現。該菌種為出入境檢疫、畜牧獸醫、食品衛生、公共衛生檢測中的重要指標之一，屬于必檢項目之一。當前臨床上主要是將沙門氏菌的ssaN，invA基因作為靶基因，建立FQ-PCR的方式進行檢測。也有學者試著將ivnA mRNA作為模板，結合反轉錄PCR技術，也在一定程度上提升了活菌檢測結果的準確性[4]。②志賀菌：該菌種屬于細菌性痢疾中最常見的病原菌類型。各型痢疾桿菌均能夠釋放出強烈的內毒素，而內毒素在作用到腸壁時，則會使得腸壁的通透性增高，進一步促進機體吸收內毒素，導致患者出現中毒性休克、神經障礙及發熱等表現。此外，膿血便產生的原因即為內毒素作用于腸壁神經系統，導致患者出現一種里急后重、腸道損傷癥狀。有學者通過將志賀菌CssrB基因的一段特異性核酸序列為靶標，并將設計帶有FAM熒光基團標記的發卡探針為對象，最終驗證該檢測方式能穩定、靈敏地檢測出志賀菌，為該菌種診斷提供了一類全新的方式[5]。③副溶血性弧菌：該菌種涉及的食品主要為海產品（貝類、蟹類、魚蝦）等制品，是由其直接或間接污染所導致。據權威數據顯示，在海產品中，副溶血性弧菌的帶菌率可高達45%以上。而引起食物中毒的季節主要在夏秋之間，屬于食源性疾病中最常見的致病微生物之一。而在人們生活質量不斷提升的今天，人們所食用的海產品數量也在不斷增加，故因該菌感染所中毒的患者數量也在不斷增加。當前主要將其中的gyrB、toxR、trh、tdh基因作為靶基因進行的FQ-PCR檢測。有學者將位于toxR基因上的特異性片段作為靶基因，并應用PGM-T為載體構建重組質粒，最終結果顯示，這類檢測結果靈敏度較佳，為40拷貝/反應體系，且變異系數較低，均為5%以下[6]。④金黃色葡萄球菌：該菌種是一種廣泛存在于自然界中的革蘭陽性菌類型，是導致細菌性食物中毒發病的主要致病菌之一。該菌種可通過與空氣接觸的方式傳播對食品造成污染。據權威數據統計顯示，金黃色葡萄球菌能在多種食品中檢出，污染范圍較為廣泛。若是食物本身的加熱溫度不夠，食物中的菌種未能被有效殺死，可能導致食物中毒發生。從檢測手段上看，傳統的平板和血平板檢測法檢測存在靈敏度低、耗時長及可能產生假陽性檢測結果的問題。應用FQ-PCR檢測技術時，則主要以金黃色葡萄球菌中的耐熱核酸酶基因、腸毒素作為靶基因，能夠起到提升檢出率的效果。也有學者引入了免疫磁性分離、基質增融等的樣本前處理方式，分析其對實驗結果的影響。結果發現基質增容及浮選法可允許在1-10CFU/ml的細胞中進行定量檢測，這能使低濃度樣本情況下細菌的檢出率得到有效提升[7]。⑤諾如病毒又被稱為膿融病毒，該病菌在全年均可感染，且在冬季發生感染的概率最高。大多數患者發病是因食物中毒所引起的腹瀉導致。該病毒能夠通過被感染者污染的糞便、飛沫接觸、未煮熟的貝類、海鮮、食物、被污染的水源等傳播。從感染的人群上看，孩子、老人等體質比較弱的人最容易感染。由于感染諾如病毒后，患者自身腹瀉的癥狀及臨床表現是有所差異的，故在致病菌分辨及檢查上需進行嚴格劃分，避免出現誤診誤治的情況發生。一般臨床上進行FQ-PCR檢測時的靶基因為諾如病毒GI型和GⅡ型靶基因ORF1及ORF2[8]。⑥輪狀病毒感染在2歲以下的嬰幼兒中較為常見。發病后患者的早期癥狀主要包括嘔吐及發熱等，隨后將出現腹瀉的癥狀，甚至出現脫水的表現。該病毒對機體多個臟器均有影響。該病屬于自限性疾病類型，自然病程5-8天，屬于嬰幼兒常見致死病因。一般臨床上進行檢測時的基因是對輪狀病毒NSP5靶基因保守區域設計多對引物，利用探針篩選[9]。

從檢測原理上分析，FQ-PCR技術是在常規PCR技術上所發展出來的一種高靈敏度核酸定量技術。該技術是在熒光染料激發的作用下利用熒光的光能變化，直接將PCR擴增產物量的變化予以反應[10]。本次結果顯示，研究中所應用的技術能夠檢測低濃度拷貝下的病原體核酸。而分子信標技術的應用，也使得FQPCR檢測方式的靈敏度得到了較大的提升。此外，從檢測準確度上看，由于FQ-PCR技術是在完全封閉的條件下進行的，能夠防止外源性因素對PCR反應產物產生影響，故提升了檢測結果的準確性。同時，PCR檢測儀進行數據分析的過程均是自動的，無需引入如紫外線燈觀測及電泳等步驟，僅需0.5-1.2h即能夠將整個PCR技術流程完成，顯著提升了檢測效率[11]。FQ-PCR檢測的PCR法與定量擴增是同步進行的，克服了PCR的平臺效應，有效地打破了傳統PCR僅能進行終點檢測的局限性。而其應用PMA技術作為DNA嵌入試劑，還能夠將死亡細菌的DNA予以清除，從源頭上避免了假陽性情況的發生。

綜上所述，在食源性細菌檢測中引入FQ-PCR檢測技術，相較于傳統的細菌檢測方式，能夠有效提升檢出率，具有一定的臨床應用價值。