頭孢菌素藥物發展和頭孢洛扎工藝開發歷程

王育盛

（南昌大學 化學學院,南昌 330031）

因為耐藥生物的發展速度超過了新型有效抗菌藥物的開發速度，細菌感染對人類健康的威脅越來越大。經過半個世紀的發展，頭孢菌素已經發展到了第5 代。至今為止，頭孢菌素仍占抗感染藥物數量的最大份額：全球累計批準了50 多種頭孢菌素藥物，幾乎占所有批準的抗菌藥物的一半。但近幾年傳染病研究及抗菌藥物研發的疲軟和抗菌新藥批準數量減少變得越發明顯。了解抗菌藥物發現過程有利于抗菌藥物的進一步發展。

1 抗菌藥物研發歷史過程

1.1 抗菌藥物研發的輝煌歷史

抗菌藥物研發的高峰期是從19 世紀30 年代到19 世紀80 年代，從歷史數據看，抗菌藥物在商業上是非常成功的。2000 年，廣譜抗菌藥和增強抗菌藥是繼抗抑郁藥和抗潰瘍藥之后銷量第三大的治療品種。2000 年美國最暢銷的50 種藥物中有5種是抗菌藥物，包括奧格門汀、環丙沙星、阿奇霉素、左氧氟沙星和克拉霉素。奧格門汀在2001 年的銷售額為18 億美元，是當年葛蘭素史克的第二大銷售藥物。作為對比，當時腫瘤藥物銷量作為一個整體甚至沒有被列入2000 年治療類別銷售的前25[1]。

1.2 抗菌藥物研發管線現狀及原因

從19 世紀90 年代開始，被批準的新抗菌藥物數量開始下降，自21 世紀，隨著當前抗菌藥物的耐藥性不斷增加，人們擔心很快會面臨沒有有效藥物治療細菌感染的狀況。2013 年，美國疾控中心CDC 發布的一份報告顯示每年美國有200 多萬人感染抗藥性細菌，每年導致23 萬人死亡[2]。全球每年因耐藥性感染導致的死亡人數約為70 萬人[3]。近年來，全球藥物研發支出逐年增加，但抗菌新藥研究與開發停滯不前。全球抗菌藥物研發面臨的最大的問題是沒有制藥企業愿意制造新的抗菌藥物，導致新抗菌藥物種類嚴重不足。與其他藥物相比，抗菌藥物的購買成本極低，但開發、試驗并將藥物推向市場的成本卻非常高。候選抗菌藥物從臨床前階段發展到臨床階段大約需要10～15 年，耗資約10 億美元，且大多數新藥在上市后的平均2～3 年內會出現耐藥性。2021 年，世界衛生組織抗生素研發管線分析指出，世界在開發新的、急需的抗生素以應對耐藥性感染方面幾乎沒有取得任何進展。

醫藥行業注意到藥物研發方向從20 世紀80年代和90 年代的治療重點（傳染病、潰瘍和心理健康）轉移到現今的腫瘤學。一些大的世界知名制藥企業紛紛裁撤研發管線，幾乎完全退出抗菌藥物市場。如2016-2019 年，制藥企業巨頭賽諾菲（Sanofi）、諾華（Novartis）和阿斯利康（AstraZeneca）等均宣布退出抗菌藥物研發管線，轉而進入利潤更為豐厚的腫瘤或其他研發領域。

抗菌藥物研發遲緩原因首先是抗菌藥物的監管環境變得越來越具有挑戰性。因為所有患者都必須接受積極治療，不能在傳染病中進行安慰劑對照臨床試驗。其次與抗菌藥物監管環境相比，癌癥及腫瘤藥物的監管環境則變得大不相同，由于在21 世紀00 年代開發了癌癥新療法，與抗菌藥物治療傳染病相比，癌癥療法的監管環境變得相對寬松。此外，癌癥療法傳統認識上具有嚴重的副作用。即使具有使人衰弱的副作用，但有效的治療藥物也可能獲得批準甚至提前上市。最后醫保報銷比例相對較低是抗菌藥物產生的收入不足的主要原因之一。目前的抗菌治療每療程從2 000 美元到6 000美元不等。相較而言舊的仿制藥則要便宜得多，并且不涉及耐藥性。因此抗菌藥物一般只被用作一線治療。此外，由于對細菌耐藥性的擔憂，新的抗菌藥物很少被使用，通常新抗菌藥物僅作為舊治療方案失敗時的最后手段。只有當舊療法產生耐藥性，這些藥物才會得到更廣泛的使用。

總之，腫瘤藥物在有利的監管環境和巨額財務回報率條件下，迅速改變了制藥行業的關注點。到2015 年，全球銷量前100 種藥物中沒有一種抗菌藥物，而抗癌藥物有19 種。目前由默克公司銷售的達托霉素，是2015 年銷量最高的抗菌藥物，銷售額為1.1 美元。21 世紀00 年代初期推出的5 種抗菌藥物有條件上市，2017 年以來，世衛組織僅批準了12 種抗菌藥物，2021 年針對優先病原體的臨床開發中只有27 種新抗菌藥物，低于2017 年的31 種產品。與腫瘤治療藥物相比，新抗菌藥物處于推出疲軟和總體投資回報不佳的狀態[4]。

1.3 抗菌藥物研發的重振

鑒于越來越多的耐藥細菌構成的重大醫學威脅，各國政府部門通過一系列舉措來激勵抗菌藥物研發。包括2010 年美國成立生物醫學高級研究與發展管理局（Biomedical Advanced Research and Development Authority，BARDA），美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)對于被指定為合格傳染病產品（qualified infectious disease products,QIDP）的藥物實行快速通道，在藥物開發期間增加了FDA 的準入，NDA 的優先審查以及額外5 年的市場獨占權等。2020 年6 月，英國啟動全球首個抗生素“訂購”計劃：英國國民醫療服務體系（The National Health Service of the United Kingdom,NHS）每年向美國輝瑞公司和日本鹽野木公司2 家制藥公司投入1 000萬英鎊的固定研發費用，以激勵新抗菌藥物的開發；2020 年9 月，瑞典啟動對新抗生素研發、測試和上市簽訂合同的“訂購”模式，以確保抗生素供應；2021 年，美國通過《啟動抗生素訂購以終止耐藥性激增（PASTEUR）法案》。這些激勵措施、計劃和法案，將有助于重振行業、激活抗菌藥物市場，并努力構建一個可以應對超級細菌的強大“武器庫”[1]。

2 頭孢菌素藥物的發展過程

2.1 頭孢菌素的發現

頭孢菌素發展史大約開始于70 年前，當時意大利科學家Giuseppe.Brotzu 發現從污水出口附近的海水中培養的頂頭孢霉菌含有對傷寒沙門氏菌（引起傷寒的細菌）具有活性的化合物。1948 年牛津大學的Abraham、Newton 和同事經聯系從Brotzu 得到菌株并開始研究，從頭孢菌素菌株中分離出許多化合物，包括他們命名為頭孢菌素P1～P5 的的5 個密切相關化合物，以及單獨的化合物頭孢菌素C、N、P（見圖1），后來經進一步研究發現頭孢菌素N 和P 其實不是頭孢菌素，其中頭孢菌素P 是一種甾體，而頭孢菌素N 其實是青霉素N。該團隊在1961 年根據紅外光譜、元素分析和創造性降解研究確定了頭孢菌素C 的結構[5]，科學家們發現頭孢菌素的核心是7-ACA（7-氨基頭孢烷酸），在研究中證實與青霉素核心結構6-APA（6-氨基青霉烷酸）相似。

圖1 頭孢菌素化合物Fig. 1 Cephalosporin Compounds

雖然頭孢菌素C 的活性不足以開發為抗菌藥物，因為其對金黃色葡萄球菌的活性僅為芐青霉素的0.1%左右。但與青霉素相比頭孢菌素C 有著獨特的重要特性：頭孢菌素C 在酸性溶液中的穩定性有所提高，并且對青霉素酶具有抗降解性。隨著第一批頭孢菌素藥物上市，頭孢菌素C 第3 個重要特性也被發現，即出現青霉素常見的嚴重過敏反應的患者要少得多。這3 個關鍵特性表明頭孢菌素C的類似物相對于已經廣泛使用的青霉素藥物可能更具有優勢。

2.2 頭孢菌素藥物開發過程

2.2.1 頭孢菌素7-ACA 工藝發展及頭孢噻吩的發現

1961 年，當科學家們解析確證頭孢菌素C 的分子式時，科學家已經知道青霉素的酰胺水解產物6-APA(6-氨基青霉酸)可以通過青霉素酶促水解發酵進行制備。該中間體被證明可作為制備具有改進性能的新青霉素類似物的支架。頭孢菌素C相應的酰胺水解產物7-ACA 無法通過當時的技術發酵制備得到，需要通過化學途徑合成，這相當具有挑戰性。1961 年，牛津大學的Abraham、Newton 團隊通過用1 N 鹽酸水溶液水解2 g 頭孢菌素C 獲得少量7-ACA，然后通過離子交換色譜分離，得到微量粗品。研究結果發現7-ACA 對葡萄球菌的抗菌活性是頭孢菌素的幾百倍[1]。

與此同時，工藝化學家考慮到β-內酰胺環的不穩定性，涉及直接酰胺水解的路線是不可行的。他們的工作努力集中在活化酰胺以得到一種在溫和條件下易于水解的結構。在1962 年他們發表的創新兩步法（見圖2）[6]，涉及用亞硝酰氯（NOCl）處理頭孢菌素C，經胺重氮化，然后插入酰胺羰基生成中間體亞氨基醚。亞硝酰氯是一種氧化劑，可以在水解之前通過蒸發輕松去除。在乙酸作為溶劑條件下，反應分離得到7-ACA（產率為7%）。正如經常發生的那樣，一旦實現了第1 個突破，改進就會迅速跟進。當溶劑改為頭孢菌素C 在其中具有更大溶解度的甲酸時，產率提高到40%。使用乙腈或硝基烷烴作為溶劑產率提高至50%，并且用甲醇淬滅殘留的亞硝酰氯避免了濃縮至干燥的繁瑣工藝。

圖2 頭孢菌素C 轉化為7-ACA 的工藝Fig. 2 Process for Conversion of Cephalosporin C to 7-ACA

科學家們繼續開發將頭孢菌素C 轉化為7-ACA 的工藝。到1969 年，優化得到了一條總產率＞90%的路線，其中涉及羧酸和胺基團的硅烷化，使用五氯化磷（PCl5）將酰胺轉化為亞氨基氯化物，然后水解[7]。

19 世紀80 年代，一種允許使用頭孢菌素C 粗品為原料的兩步酶法路線（見圖3）被開發出來[1]。在酶促過程的第1 步中，頭孢菌素C 粗品經過D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)氧化脫氨基轉化為α-酮己二酰-7-ACA。在該反應中釋放過氧化物，誘導氧化脫羧得到戊二酰-7-ACA。在第2 個酶促步驟中，使用酰化酶水解戊二酰-7-ACA 以產生7-ACA 和戊二酸。在此基礎上Boehringer Mannheim 開發了一條使用固定在聚合物上的DAAO 催化的高效工藝，在步驟1 中有94%的轉化率，在步驟2 中有96%的轉化率，每步反應時間都只有30 min 左右，大大提高了產能。

圖3 頭孢菌素C 到7-ACA 的生物催化轉化Fig. 3 Biocatalytic Conversion of Cephalosporin C to 7-ACA

憑借可用于生產7-ACA 的工藝，禮來的藥物化學家制備和評估各種酰胺側鏈，最終促成了頭孢噻吩（Cephalothin）臨床開發和成功上市。在7-ACA 結構發表后，頭孢菌素藥物得到快速發展[8]。1964 年頭孢噻吩作為第1 代頭孢藥物被批準上市銷售。如今大部分7-ACA 都是通過生物催化路線制造的。

2.2.2 頭孢菌素：GCLE 的發現和工藝發展

據統計，截止至2000 年，全球大約累計生產了200 萬kg 的7-ACA。雖然它是許多科學家早期頭孢菌素藥物開發所喜歡使用的起始物料，但從20世紀80 年代開始，科學家們更傾向于選擇使用更易得的起始物料：3-氯甲基-7-(2-苯基乙酰氨基)-3-頭孢烯-4-甲酸4-甲氧基芐酯(3-Chloromethyl-7-(2-phenylacetamido)-3-cephem-4-carboxylic Acid 4-Methoxybenzyl Ester，GCLE)進行開發。GCLE的烯丙基氯可以輕松修飾10 位，而羧基的保護有更廣泛的范圍可供選擇，進而使在分子的其他位置建立結構多樣性成為可能。

GCLE 的工藝合成一般是以青霉素G 鉀鹽作為起始原料開始制備的。最早將青霉素作為原料合成制備頭孢菌素結構的化學反應是由禮來團隊開發的（見圖4）。其描述的路線是建立在早期研究工作基礎上，盡管存在許多變體但該路線說明了該化學反應的常見轉化順序和使用的試劑種類。

圖4 從青霉素G 到GCLE 的轉化途徑Fig. 4 Route to GCLE from Penicillin G

該方法是從青霉素G 鉀鹽開始，第一步經過上對甲氧基芐基（P-methoxy benzyl，PMB）得到青霉素G 羧酸對甲氧基芐基酯3。優選對甲氧基芐基是因為對甲氧基芐基基團可以在最后一步脫保護基得到頭孢菌素產物。在對甲氧基芐基保護后下一步用過氧乙酸將硫氧化成亞砜4。亞砜與開環的亞磺酸5 處于互變平衡狀態，當亞磺酸5 被2-巰基苯并噻唑捕獲形成6，然后使用苯亞磺酸轉化為硫代磺酸鹽7。7 經氯化得到烯丙基氯8，它與氨反應通過在4 位去質子化，然后通過雙分子親核取代反應（substitution nucleophilic 2，SN2）取代硫生成的碳負離子以釋放苯亞磺酸鹽，使六元環閉環得到GCLE，文獻報道氨是這種轉化的獨特堿，產率為93%，遠高于篩選的其他堿。

隨著技術發展，GCLE 的生產成本已經大幅降低。GCLE 是繼7-ACA 之后合成頭孢菌素藥物又一新的重要中間體[9]，對于新的頭孢藥物開發也十分關鍵，也將有更廣闊的用途和市場。

2.2.3 頭孢類藥物分類

鑒于在頭孢噻吩（Cephalothin）發現后的20 年間批準了大量頭孢菌素藥物。1987 年，根據微生物學特征，Williams 對頭孢菌素藥物引入了分類系統，為醫生給患者選擇適當藥物提供了依據。頭孢菌素現在按“代”分類，現已達到5 代。頭孢菌素分類及典型藥物見表1[1]。

表1 5 代典型的頭孢菌素藥物Tab.1 Five Generations of Typical Cephalosporin Drugs

第1 代頭孢菌素類藥物主要對葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有活性，如頭孢噻吩。到1970 年代，因為細菌β-內酰胺酶的進化，使耐藥性變得常見，使得第1 代頭孢菌素類藥物無效。第2 代藥物的頭孢菌素藥物是在第一代頭孢藥物官能團上修飾得到，一個重要改進是在側鏈中引入了一個α-烷氧基亞氨基。頭孢呋辛是第2 代頭孢菌素藥物典型代表。其新引入的基團使β-內酰胺酶的穩定性提高了2 個數量級，而新引入的Z-肟結構的穩定性比E-肟穩定近2 萬倍。第3 代藥物的烷氧基亞氨基側鏈更大更復雜，目的是使藥物對β-內酰胺酶和噻唑鏈穩定作用進一步加強，如頭孢噻肟。它針對革蘭氏陰性生物改進而提供活性。為了加強對細菌的活性，第3 代頭孢藥物引入了鎓鹽結構。第4、5 代頭孢藥物中，中鎓鹽片段更為普遍，它們對耐藥菌具有更高的功效，頭孢洛扎就是第5 代頭孢藥物的典型代表。

3 頭孢洛扎的發現

3.1 頭孢洛扎的化學結構

頭孢洛扎分子結構如下（見圖5）

圖5 頭孢洛扎Fig. 5 Ceftolozane

頭孢洛扎化學分子式為C23H30N12O8S2，分子量為666.69，頭孢洛扎上市藥品一般為硫酸鹽，即硫酸頭孢洛扎，分子式為C23H31N12O8S2+·HSO4-，CAS 號為936 111-69-2。

3.2 頭孢洛扎的發現及研究

頭孢洛扎是由Astellas Pharma 和Wakunaga Pharma 發現的。2007 年，Astellas Pharma 將頭孢洛扎商業開發權益轉給了Calixa，Calixa 開始將頭孢洛扎與他唑巴坦聯合開發成抗感染復方制劑。2009 年，由于Cubist 兼并收購，Calixa 成為了其子公司，并于2013 年，從Astellas Pharma 手中買斷了頭孢洛扎硫酸鹽及頭孢洛扎硫酸鹽與他唑巴坦聯合開發的權利，賦予Cubist 全球權利。2015 年默沙東收購了Cubist，獲得了頭孢洛扎全部的開發權益[10-11]。

Zerbaxa 是頭孢洛扎和他唑巴坦的復方制劑[12-13]，在2014-2015 年，相繼通過FDA 和歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）審批上市，用于治療尿路和腹腔感染。頭孢洛扎是典型的第5 代頭孢藥物，用于治療對前代抗菌藥物產生抗性的革蘭氏陰性菌（包含銅綠假單胞菌和耐β-內酰胺類腸桿菌）引起的感染。與之聯合使用的他唑巴坦則是一款經典的β-內酰胺酶抑制劑藥物[14]。

頭孢洛扎是與頭孢他啶相似的抗生素，化學結構與頭孢他啶相似，對銅綠假單胞菌具有高效的抗菌作用。美國和歐洲醫學中心收集到2 968 份肺炎標本并研究藥物抗菌活性，研究數據表明與其他藥物相比，頭孢洛扎與他唑巴坦復方藥物對銅綠假單胞菌的抗菌活性最佳，其次是美羅培南。隨機、雙盲、多中心Ⅱ期臨床試驗比較了頭孢洛扎/他唑巴坦與甲硝唑/美羅培南治療復雜性腹腔內感染（complicated intra-abdominal infections，cIAI）的療效，結果顯示2 組患者均取得滿意的療效。根據20 多個國家200 多個臨床中心1 000 多例患者的臨床試驗，比較了頭孢洛扎/他唑巴坦與左氧氟沙星治療尿路感染或腎盂腎炎的治療效果，臨床實驗數據顯示頭孢洛扎/他唑巴坦復方制劑效果明顯優于左氧氟沙星。頭孢洛扎體外抗菌作用與其他頭孢菌素抗菌作用機制一致，都是通過抑制青霉素結合蛋白發揮殺菌作用，通過抑制細胞壁合成，最終細胞裂解死亡[15]。

4 頭孢洛扎工藝路線研究進展

最新的Cubist 和默沙東的專利申請中主要描述了3 種制備頭孢洛扎的方法。

4.1 方法1：從GCLE 作為起始物料制備頭孢洛扎

在Cubist 和默沙東公司專利中描述的第1 條路線與GCLE 制備頭孢洛扎的藥物化學路線相同。專利實驗部分提供了詳細的制備過程，提出了對合成頭孢洛扎化學工藝的挑戰和后處理及純化的見解思路，其分步制備過程如下。

4.1.1 GCLE 到ACLE 的轉換

盡管7-氨基-3-氯甲基-3-頭孢-4-羧酸對甲氧基芐基酯鹽酸鹽（7-amino-3-chloromethyl-3-cephem-4-carboxylic acid p-methoxybenzyl ester,ACLE)是一種市售物料，但其制備方法之前未在文獻中得到很好的記錄。GCLE 側鏈的水解在公開專利中進行了詳細描述。每個都遵循類似于頭孢菌素C側鏈裂解的過程，即形成亞氨基氯化物，然后水解。

美國專利US20160176897 描述了270 kg 規模GCLE 轉化到ACLE 的工藝（見圖6）[16]。實驗方案如下：將五氯化磷（物質的量分數為2.0）加入二氯甲烷并冷卻至-10 ℃，然后緩慢加入吡啶（物質的量分數為2.0）并保持溫度低于5 ℃。在-10～0 ℃的溫度下加入GCLE（物質的量分數為1.0）；低溫有利于減少β-內酰胺的C7-氨基中心的差向異構化，當反應完成，得到化合物9 反應液。將反應體系冷卻至-20 ℃加入正丁醇（物質的量分數為2.0），形成亞氨基醚化合物10。此時需要低溫條件以最大限度地減少向GCLE 的轉化。以將亞氨基-醚水解成胺得到ACLE。分層后濃縮有機層，然后加入乙酸乙酯析出得到ACLE 鹽酸鹽（產率：87%，純度＞97%）。結晶產物中的主要雜質是2-氯-對甲氧基芐基產物，其中氯的親電加成發生在甲氧基的鄰位。由于該部分在三氟乙酸脫保護過程中也被裂解生成目標產物，因此雜質的含量對產物質量無明顯影響。

圖6 GCLE 轉化為ACLE-HCl 的過程Fig. 6 Conversion of GCLE to ACLE

4.1.2 ACLE 向中間體10 甲苯溶劑化物的轉化

噻二唑基-肟基乙酸側鏈((Z)-2-[[1-(tertbutoxycarbonyl)-1-Methylethoxy]iMino]-2-(5-AMino-[1,2,4]thiadiazol-3-yl)-acetic acid,TATD）與ACLE 的偶聯反應在默沙東WO2016/025813專利中以99 kg 規模進行了描述（見圖7）[17]。側鏈TATD 在3～7 ℃ N,N-二甲基乙酰胺（N,NDimethylacetamide,DMAc）中用碳酸鉀作為堿進行甲磺酸酯化。后處理體系用乙酸乙酯稀釋，依次用1.7%鹽酸水溶液，10%氯化鈉水溶液洗滌得到化合物11 的有機相溶液。然后將有機溶液直接用于偶聯步驟，偶聯步驟在0～5 ℃水和乙酸乙酯兩相體系中進行，用三乙胺將pH 調節至3.2～3.8。后處理添加氯化鈉固體攪拌溶解，分離水層，再用氯化鈉水溶液洗滌。然后將有機層濃縮，加入甲苯，分離出TATD-CLE 的結晶甲苯溶劑化物，反應總產率為90%，純度約99%。專利中要求保護的結晶甲苯溶劑化物TATD-CLE。

圖7 ACLE 向TATD-CLE 甲苯溶劑化物的轉化Fig. 7 Conversion of ACLE to TDTD-CLE .Toluene

4.1.3 中間體TATD-CLE 向頭孢洛扎三氟乙酸鹽的轉化

27～30 ℃，中間體TATD-CLE 與吡唑側鏈（[2-[[[1-甲基-5-[(三苯甲基)氨基]-1H-吡唑-4-基]氨基甲酰基]氨基]乙基]氨基甲酸叔丁酯，UBT，物質的量分數為1.2）在N-甲基吡咯烷酮（Nmethyl-2-pyrrolidone，NMP）中與六甲基二硅脲（1,3-bis(trimethylsilyl)urea，BSU，物質的量分數為3.6）和碘化鉀（物質的量分數為1.8）存在條件下進行反應（見圖8）[17]。過程監測中間體碘化物的生成及消耗來監測反應進行程度。反應完成后，后處理放體系中添加二氯甲烷（dichloromethane,DCM），然后用pH=4～6 的4.4%氯化鈉水溶液（用鹽酸溶液調節pH）在0～5 ℃洗滌分液去除水相，0～5 ℃有機相用硫代硫酸鈉洗滌一次后再用15%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）洗滌3 次，12 的三氟乙酸鹽在二氯甲烷溶液直接用于下一步。據報道該階段溶液產率為48-57%[18]。

圖8 頭孢洛扎三氟乙酸鹽的制備過程Fig. 8 Preparation of Ceftolozane Trifluoroacetate

下一步將12 的三氟乙酸鹽的二氯甲烷溶液減壓濃縮，然后加入苯甲醚(0.7 體積)和三氟乙酸(5體積)以實現基團：PMB、叔丁氧羰基（Tert-Butyloxycarbonyl,Boc）、三苯甲基和叔丁基（tert butyl,t-Bu）的脫保護。后處理先在-35 ℃下加入二氯甲烷后攪拌分液，去除上層二氯甲烷相。下層包含產品和三氟乙酸，而上層包含二氯甲烷和苯甲醚。將乙腈加入到下層產物層中，然后通過滴加甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）使頭孢洛扎三氟乙酸鹽結晶析出。（產率63%，純度78%）。

4.1.4 轉化為頭孢洛扎硫酸鹽

頭孢洛扎三氟乙酸鹽向硫酸鹽的轉化過程專利中進行了詳細描述[19]。為了去除不溶性雜質，將三氟乙酸鹽溶解在水中，并用氨水溶液調節pH 至1.5 并攪拌20 min。添加珍珠巖，然后過濾物料，從而去除不溶性雜質。為了去除非極性雜質，將上述過濾后的溶液在24～26 ℃下通過型號為：HP20L的樹脂柱并用酸水(pH=1.5)洗脫。在0～8 ℃的溫度下，用氨水將產品溶液pH 調至6.4～7.0。經過樹脂處理，物料純度從7%～80%提高到92%～95%。合并產品溶液通過膜技術（納米過濾）將產品溶液濃縮約至80 g/L。硫酸鹽的結晶是通過8～12 ℃向上述80 g/L 產品溶液中滴加硫酸（物質的量分數為2.5）成鹽，然后加入異丙醇來完成產品析晶純化得到硫酸頭孢洛扎[20]。

4.2 方法2：逆序合成頭孢洛扎

美國專利US20140274958 中描述了另外一條頭孢洛扎合成路線[21]，該路線（見圖9）以ACLE 的水楊醛亞胺SCLE（7-水楊醛亞胺基-3-氯甲基-3-頭孢-4-羧酸對甲氧基芐基酯）為起始合成原料，它是一種由ACLE 和水楊醛制備的市售材料。在該合成路線中，兩側鏈以與之前報道路線相反的順序進行偶聯。吡唑側鏈UBT 首先在N-甲基吡咯烷酮中在碘化鉀和雙 (三氟甲基)乙酰胺(bistrifluoroacetamide，BSA)存在條件按下與原料SCLE 進行偶聯得到中間體13，由側鏈TATD與甲磺酰氯反應生成甲磺酸酯11，甲磺酸酯11 與中間體13 發生取代反應以86%的產率得到中間體12。此步驟相對于使用原料TATD-CLE 反應（產率47%～65%），產率有很大提高。后續向中間體12 體系中加入甲基叔丁基醚，中間體12 結晶析出得到其三氟乙酸鹽，產率81%。后續中間體12按照上述路線一步驟整體脫保護進一步轉化為頭孢洛扎，然后進行鹽交換和與硫酸鹽成鹽結晶得到目標產物硫酸頭孢洛扎。

圖9 ACLE-亞胺轉化為頭孢洛扎中間體12Fig. 9 Conversion of ACLE-Imine to Ceftolozane Intermediate 12

4.3 方法3：吡唑側鏈的C—N 交叉偶聯

在迄今為止討論的路線中，吡唑側鏈都是通過烯丙基氯的SN2 取代縮合得到的（使用碘化鉀轉化為碘化物）。默沙東專利中報告的該步驟的產率為47%～86%。作為替代方法，專利WO2016/025839申請描述了通過鈀催化的交叉偶聯形成這種鍵的方法（見圖10）[22]，產率提高到了92%～96%。

圖10 C-N 交叉偶聯方法制備頭孢洛扎Fig. 10 C-N cross coupling approach to ceftolozane

工藝是通過中間體TATD-CLE 與吡唑側鏈UBT 在三氟乙酸鉀、四氫呋喃、亞磷酸三-（4-二甲氨基苯基）酯和三(二亞芐基丙酮)二鈀）存在下室溫條件發生偶聯反應生成中間體三氟乙酸酯14。三氟乙酸酯14 作為短暫中間態后續進一步轉化為中間體12。后處理通過水溶液洗滌、除鈀[23]。三氟乙酸脫對PMB、Boc、t-Bu 得到頭孢洛扎，三氟乙酸鹽固體。總產率為78%，純度為90%，后續再經過鹽型轉化得到硫酸頭孢洛扎。

4.4 頭孢洛扎工藝路線對比及結果

經過以上頭孢洛扎工藝合成方法對比發現，第1 條工藝合成路線遵循與原研藥物化學團隊描述的相同的路線，雜質多，純化難度大，且在頭孢洛扎原料藥純化過程需要采用樹脂純化納濾濃縮等操作。

第2 條路線從GCLE 的水楊醛亞胺開始，并以相反的順序附加側鏈。該路線同第1 條路線對比發現，雖然制備中間體頭孢洛扎三氟乙酸鹽收率有了明顯提高，在后處理純化過程難度大大降低。但是合成起始物料GCLE 的水楊醛亞胺價格較高，且現無大批量供應，需要自己合成制備。

第3 條路線是前2 條路線的緊密變體，在工藝中采用鈀催化實現C-N 交叉耦合取代路線1 和路線2 中的SN2 取代反應，從而提高了該步驟的收率。該工藝在成品純化因得到的中間體頭孢洛扎三氟乙酸鹽純度高，從而規避了樹脂純化和納濾濃縮操作，相對于路線1 和路線2 簡化了后處理純化操作過程，主要的缺點是該工藝路線步驟使用了成本較高的鈀催化劑和與之配位的膦配體，但使用量可以持續優化，整條路線相對于路線1 和路線2 反應步驟短，工藝易于操作且收率高從而降低了生產成本。所以第3 條合成路線更具優勢。

5 抗菌藥物研發展望及頭孢洛扎工藝研究結論

頭孢菌素藥物發展經由歷史輝煌轉而研發遲緩進而到現在全球積極推進新的抗菌藥物管線研發并取得一系列積極成果。對于最新“代”的頭孢菌素藥物：頭孢洛扎，在近年來生產工藝及技術也有了較大的發展。文獻及專利中主要報道了3 種最可能適合工業生產的路線。路線3 相對于路線1 和路線2 簡化了后處理純化操作過程，整條路線相對于路線1 和路線2步驟短，工藝易于操作且收率高從而明顯降低了生產成本，該工藝路線更具優勢和研究價值。頭孢洛扎作為第5 代頭孢菌素的典型代表，除了原研廠家，國內暫未有企業申請上市銷售。對頭孢菌素藥物發展介紹和對頭孢洛扎工藝合成路線研究對后期頭孢洛扎在我國的發展具有重要參考價值。研發生產企業可結合自身生產條件參考以上3 條路線進行開發改進，得到一條適合生產企業條件的，能穩定生產的綠色工藝路線，為頭孢洛扎的進一步研究發展提供支撐。